MiRNA-363-3p/DUSP10/JNK軸參與彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤化療耐藥

蒽環(huán)類化療耐藥是彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）面臨的主要挑戰(zhàn)。我們觀察并驗(yàn)證了miRNA-363-3p的高表達(dá)與化療耐藥性之間的獨(dú)立相關(guān)性。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，MiRNA-363-3p可通過(guò)DLBCL細(xì)胞系中的異位表達(dá)和CRISPR/Cas9介導(dǎo)的敲除減少阿霉素誘導(dǎo)的凋亡和腫瘤縮小。我們還發(fā)現(xiàn)DNA甲基化參與了miRNA-363-3p的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。進(jìn)一步研究表明，DUSP10是miRNA-363-3p的靶點(diǎn)，其抑制可促進(jìn)JNK磷酸化。miRNA-363-3p/DUSP10/JNK軸主要與同源重組（HR）和DNA修復(fù)途徑的負(fù)調(diào)控相關(guān)。miRNA-363-3p的異位表達(dá)可更有效地修復(fù)阿霉素誘導(dǎo)的雙鏈斷裂（DSB），同時(shí)增強(qiáng)非同源末端連接修復(fù)，減少HR修復(fù)。靶向JNK和聚ADP核糖聚合酶1可顯著抑制阿霉素誘導(dǎo)的DSB修復(fù)，增加阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和腫瘤縮小，提高荷瘤小鼠的生存率?？傊?，miRNA-363-3p/DUSP10/JNK軸是DLBCL中一種新的耐藥機(jī)制，可通過(guò)靶向治療逆轉(zhuǎn)。本文于2022年3月發(fā)表于Leukemia（IF=11.528）雜志上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）高水平的miRNA-363-3p與蒽環(huán)類化療耐藥顯著相關(guān)

對(duì)47例DLBCL患者冷凍保存的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行MiRNA表達(dá)譜分析。耐藥組的miRNA-363-3p水平顯著升高（圖1A）。miRNA-363-3p水平高的患者表現(xiàn)出不利的PFS（圖1B）。在B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系中也觀察到miRNA-363-3p水平的高差異。在治療48小時(shí)后，miRNA-363-3p水平與阿霉素(25 ng/ml)誘導(dǎo)的6株DLBCL細(xì)胞和3株DLBCL患者腫瘤細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)(圖1C)。在miRNA-363-3p異位的OCI-Ly8中觀察到阿霉素誘導(dǎo)的凋亡顯著減少，而在CRISPR/cas9介導(dǎo)的miRNA-363-3p敲除的OCI-Ly3中檢測(cè)到凋亡顯著增加(圖1D)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miRNA-363-3p表達(dá)與阿霉素耐藥之間的關(guān)系。與OCI-Ly3載體相比，阿霉素誘導(dǎo)小鼠腫瘤明顯縮小，而miRNA-363-3p的異位表達(dá)顯著降低了阿霉素對(duì)OCI-Ly8的作用(圖1E, F)。

2）MiRNA-363-3p受DNA甲基化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

CpG島周圍1.258 kb的序列被預(yù)測(cè)為候選miRNA-363-3p啟動(dòng)子，其功能通過(guò)熒光素酶活性來(lái)驗(yàn)證（圖2A）。生物信息學(xué)分析顯示，在CpG島上有四個(gè)MYC結(jié)合的E盒元件。通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀+ PCR法確定E-box-2為MYC的精確結(jié)合位點(diǎn)。值得注意的是，在OCI-Ly3中MYC的結(jié)合水平高于OCI-Ly8(圖2B)。亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR位點(diǎn)特異性DNA甲基化分析發(fā)現(xiàn)，OCI-Ly3中E-box-2周圍的CpG甲基化低于OCI-Ly8 (圖2C)。通過(guò)觀察到耐藥患者的甲基化水平低于敏感患者和naive、中心母細(xì)胞、中心細(xì)胞B細(xì)胞(圖2D)，進(jìn)一步驗(yàn)證了甲基化對(duì)miRNA-363-3p表達(dá)的影響(圖2D)。在耐藥和敏感患者中，女性與男性的比例均為2:1，平衡了性別對(duì)x染色體DNA甲基化的影響，而且MYC的異位表達(dá)并沒有顯著增加OCI-Ly8中miRNA-363-3p的水平(圖2E)。綜上所述，這些結(jié)果證實(shí)了miRNA-363-3p除了MYC外，還受DNA甲基化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

3）MiRNA-363-3p直接抑制DUSP10表達(dá)，然后增強(qiáng)JNK磷酸化

我們通過(guò)DLBCL患者的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)和軟件預(yù)測(cè)確定了DUSP10、FOXG1和CACNA1C為候選靶基因。為了檢測(cè)miRNA-363-3p對(duì)這些基因的直接調(diào)控，我們進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。結(jié)果表明，miRNA-363-3p模擬物顯著抑制含有DUSP10和CACNA1C基因3′UTR的質(zhì)粒的熒光素酶活性，但不抑制FOXG1基因的3′UTR（圖3A）。據(jù)報(bào)道，CACNA1C會(huì)影響利妥昔單抗耐藥性。在此，我們重點(diǎn)研究了DUSP10在化療耐藥性中的作用。Western blot分析證實(shí)，DUSP10蛋白在miRNA-363-3p-異位表達(dá)的OCI-Ly8中減少，而在miRNA-363-3p-敲除的OCI-ly3中增加（圖3B）。106例DLBCL患者的DUSP10表達(dá)與miRNA-363-3p和化療耐藥性呈負(fù)相關(guān)（圖3C）。據(jù)報(bào)道，JNK和p38受到DUSP10介導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路的去磷酸化的負(fù)調(diào)控。我們發(fā)現(xiàn)，在miRNA-363-3p-異位表達(dá)的OCI-Ly8中，磷酸化JNK的水平增強(qiáng)，而在miRNA-363-3p-敲除OCI-Ly3中，磷酸化JNK的水平降低（圖3B）。磷酸酶死亡的DUSP10 (C408S)進(jìn)一步驗(yàn)證了miRNA-363-3p/DUSP10/JNK軸在DLBCL細(xì)胞中的功能(圖3D)。

4）MiRNA-363-3p相關(guān)的耐藥性與阿霉素誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂（DSB）修復(fù)增強(qiáng)有關(guān)

我們對(duì)78個(gè)抗性相關(guān)上調(diào)基因進(jìn)行David通路分析，發(fā)現(xiàn)DNA損傷修復(fù)途徑是富集的，包括HR的負(fù)調(diào)節(jié)（RECQL5，POLQ）和DNA修復(fù)（FAAP100，RECQL5，DDX11，TICRR，PSME4，POLQ，SMC1A）（圖4A）。γH2AX是已知的DSB生物標(biāo)記物。miRNA-363-3p敲除導(dǎo)致OCI-Ly3細(xì)胞中阿霉素誘導(dǎo)的γH2AX水平增加（圖4B）。此外，miRNA-363-3p表達(dá)的變化不影響TP53和BCL2蛋白的水平。正如預(yù)期的那樣，ATF2和磷酸化ATF2的水平與miRNA-363-3p表達(dá)呈正相關(guān)（圖4C）。DSB主要由HR和NHEJ修復(fù)，偶爾也由容易出錯(cuò)的替代NHEJ修復(fù)。使用報(bào)告質(zhì)粒系統(tǒng)，我們證實(shí)miRNA-363-3p模擬物顯著降低293 T細(xì)胞的HR活性，但增加NHEJ和選擇性NHEJ活性；miRNA-363-3p抑制劑顯示出相反的作用（圖4D）。RAD51是HR修復(fù)的核心分子。免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，阿霉素誘導(dǎo)的RAD51病灶通過(guò)miRNA-363-3p的異位表達(dá)而明顯減少，但通過(guò)miRNA-363-3p的敲除而增加（圖4E）。

5）通過(guò)抑制JNK和PARP1逆轉(zhuǎn)miRNA-363-3p相關(guān)的化療耐藥性

PARP1抑制劑已被證明對(duì)缺乏HR的癌細(xì)胞有顯著療效。因此，我們?cè)u(píng)估了pan-JNK抑制劑SP600125和PARP1抑制劑BGB-290克服DLBCL細(xì)胞中與miRNA-363-3p/DUSP10/JNK軸相關(guān)的化療耐藥性的潛力。結(jié)果表明，它們明顯增強(qiáng)了高miRNA-363-3p表達(dá)的OCI-Ly3細(xì)胞中阿霉素誘導(dǎo)的γH2AX水平（圖5A）。此外，在高表達(dá)miRNA-363-3p的細(xì)胞系中觀察到阿霉素和SP600125或BGB-290之間的明顯協(xié)同作用（圖5B）。在攜帶OCI-Ly3細(xì)胞的異種移植小鼠模型中進(jìn)一步證實(shí)了其療效。添加SP600125或BGB-290可顯著增加阿霉素誘導(dǎo)的腫瘤消退和存活率（圖5C）?？傊?，我們證明，通過(guò)抑制DLBCL細(xì)胞中的JNK和PARP1，可以逆轉(zhuǎn)miRNA363-3p相關(guān)的化療耐藥性。內(nèi)在機(jī)制如圖5D所示。

結(jié)論：我們創(chuàng)造性地提出了一種新的蒽環(huán)類耐藥機(jī)制，涉及miRNA-363-3p/DUSP10/JNK介導(dǎo)的DSB修復(fù)增強(qiáng)。針對(duì)這種耐藥機(jī)制的新方法為克服化學(xué)耐藥性提供了潛在的選擇。

參考文獻(xiàn)：

Zhou W, Xu Y, Zhang J, Zhang P, Yao Z, Yan Z, Wang H, Chu J, Yao S, Zhao S, Yang S, Guo Y, Miao J, Liu K, Chan WC, Xia Q, Liu Y. MiRNA-363-3p/DUSP10/JNK axis mediates chemoresistance by enhancing DNA damage repair in diffuse large B-cell lymphoma. Leukemia. 2022 Apr 29. doi: 10.1038/s41375-022-01565-6.