細胞質(zhì)中鐵離子分子伴侶PCBP1是一個多功能的RNA結(jié)合蛋白,參與基因的轉(zhuǎn)錄,RNA的調(diào)控,和鐵離子加載至鐵蛋白的過程。PCBP1也是眾所周知的自噬抑制分子,但是PCBP1在鐵自噬和鐵死亡中的作用尚未可知。因此,本研究旨在探究PCBP在鐵自噬介導的鐵死亡在頭頸癌中的作用。本研究于2022年5月發(fā)表在《Redox Biology》IF:11.799期刊上。
技術(shù)路線:
主要研究結(jié)果
1、PCBP1的表達和HNC的存活及鐵死亡敏感性有關(guān)
作者通過TCGA分析發(fā)現(xiàn)PCBP1的表達在正常和HNC腫瘤組織中無差異,但是低表達PCBP1的患者總體生存率顯著更高。此外,PCBP1低表達的細胞對erastin的敏感性更高,表現(xiàn)為在同濃度erastin處理下,PCBP1低表達的細胞比PCBP1高表達細胞的活力更低、死亡更多、經(jīng)歷脂質(zhì)過氧化的細胞比例更高、LIP更高(附圖1C-1I)。但是這些作用可以被ferrostatin-1或deferoxamine減緩(附圖1J)。這些結(jié)果表明PCBP1表達和HNC的存活及鐵死亡敏感性有關(guān)。
附圖1 PCBP1的表達和HNC的存活及鐵死亡敏感性有關(guān)
隨后作者通過PCBP1的功能丟失實驗驗證PCBP1與HNC細胞對鐵死亡敏感性的關(guān)系。在PCBP1高表達的HN3,HN6,HN12的細胞中敲除PCBP1,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)總鐵和亞鐵含量、LIP、ROS和細胞死亡均顯著增加,但重新表達PCBP1可以減輕上述影響(圖1A-1J)。隨著PCBP1的敲除,鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)分子表達水平發(fā)生變化,FTH1和FPN表達下調(diào),而DMT1和TFRC表達上調(diào)(圖1K-1L)。這些結(jié)果表明PCBP1敲除通過細胞內(nèi)亞鐵積累促進細胞對鐵死亡誘導劑的敏感性。
圖1敲低PCBP1增加HNC細胞對鐵死亡的敏感性
3、PCBP1負調(diào)控BECN1 mRNA
PCBP1作為RNA調(diào)節(jié)因子在翻譯過程中起著重要作用。作者通過RBP圖譜分析了BECN1 mRNA的序列,以確定PCBP1的結(jié)合區(qū)域,結(jié)果顯示預測的PCBP1的結(jié)合區(qū)域位于BECN1 mRNA的3’UTR區(qū)域(圖2A)。用于熒光素酶檢測的BECN1 mRNA片段就是從這一發(fā)現(xiàn)中產(chǎn)生的(圖2B-2C)。隨著pcDNA 3.1-PCBP1的引入,pLFL(全長片段)和pLF2(包括PCBP1結(jié)合區(qū))的熒光素酶活性降低(圖2D)。pull-down驗證了PCBP1和BECN1的結(jié)合(圖2E)。以上提示PCBP1負調(diào)控BECN1 mRNA。
4、敲除PCBP1增強了鐵自噬誘導性
使用erastin處理的情況下,與對照組比較,PCBP1敲除的細胞中自噬斑點(及與亞鐵共染斑點)數(shù)量增加、細胞活力下降、細胞內(nèi)亞鐵含量增加(圖3A-3C);此外,PCBP1敲除細胞中LC3B-II、Atg5和4-HNE表達增加,而p62、NCOA4和鐵蛋白表達減少,然而,使用巴菲霉素A1處理細胞后,LC3B-II和p62表達增加(圖3D)。PCBP1基因的敲除可顯著增加細胞中亞鐵含量和共染色點狀體的數(shù)量(圖3E-3F)。這些結(jié)果表明PCBP1阻礙了鐵自噬體的鐵離子釋放。
作者此前的研究發(fā)現(xiàn)鐵離子過載進入線粒體后會導致線粒體功能異常。此外,PCBP1敲除后,TMRE顯著下降,線粒體超氧化物和亞鐵染色強度顯著增加(附圖5)。這些研究表明PCBP敲除導致線粒體功能異常是通過增加鐵離子過載進入線粒體。
附圖5 鐵自噬引起的鐵離子過載導致線粒體功能異常。
5、PCBP1負調(diào)控脂質(zhì)過氧化
PCBP1還可以特異性調(diào)控ALOX15的3’端翻譯,ALOX15是氧化生成PUFA的關(guān)鍵分子。因此,作者接下來探究敲除PCBP1是否會導致氧化PUFA的增加。結(jié)果顯示,敲除PCBP1增加了細胞內(nèi)脂質(zhì)、氧化PUFA、游離脂肪酸水平、相關(guān)分子的表達、MDA和4-HNE水平(附圖6)。當細胞暴露于erastin或sulfasalazine時,與油酸(10 μM)相比,亞油酸(10 μM)作用時細胞活力顯著降低(附圖6F)。在PCBP1敲低的細胞中,FASN、FADS2、SCD1和SREBP1增加,在PCBP1過表達的細胞中減少(附圖6H)。這些結(jié)果表明,敲除PCBP1通過激活脂肪酸合成和ALOX15表達,促進了PUFA的生成和脂質(zhì)過氧化。
附圖6 PCBP1負調(diào)控脂質(zhì)過氧化
6、PCBP1敲除增加了腫瘤的鐵死亡易感性
最后,作者在體內(nèi)檢測敲除PCBP1是否會增加鐵死亡易感性。PCBP1-抑制組(HN12 shPCBP1)和PCBP1-過表達組(HN2 PCBP1質(zhì)粒)的腫瘤生長速度均高于載體對照組(圖4A-4C)。此外,施用sulfasalazine顯著抑制腫瘤生長:在HN12 shPCBP1中更顯著。細胞內(nèi)鐵離子含量,脂質(zhì)含量和脂質(zhì)過氧化積累在HN12 shPCBP1腫瘤中更高,并且sulfasalazine處理后更高(圖4D-4F)。在PCBP1抑制或低表達組中,經(jīng)sulfasalazine處理后ACSL4、ALOX15、4-HNE和PTGS2的表達增加,而FTH1和NCOA4的表達降低,但在PCBP1過表達組則相反(圖4G)。因此,PCBP1敲除有助于體內(nèi)鐵死亡敏感性的增加。
參考文獻
Lee Jaewang., You Ji Hyeon., Roh Jong-Lyel.(2022). Poly(rC)-binding protein 1 represses ferritinophagy-mediated ferroptosis in head and neck cancer. Redox Biol, 51(undefined), 102276. doi:10.1016/j.redox.2022.102276