lncRNA DDX11-AS1通過與HNRNPC結合促進膠質瘤細胞的增殖和遷移

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2022-07-28
DDX11-AS1/HNRNPC軸可能在膠質瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關重要的作用,這為膠質瘤的診斷、治療和預后提供了新的思路和治療靶點......

膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病機制復雜,手術難度大,術后復發(fā)率高。目前,仍然缺乏有效的治療。lncRNA DDX11-AS1已被證明可促進腫瘤的發(fā)展,如肝細胞癌、食管癌等。然而,其在膠質瘤中的分子機制尚不清楚。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)膠質瘤組織中DDX11-AS1的表達升高,DDX11-AS1高表達的患者預后不良。DDX11-AS1是一個潛在的預后標志物。在功能上,DDX11-AS1促進膠質瘤細胞增殖和遷移。在機制上,DDX11-AS1HNRNPC相互作用,促進Wnt /b-cateninAKT途徑以及上皮間質轉化過程。綜上所述, DDX11-AS1/HNRNPC軸可能在膠質瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關重要的作用,這為膠質瘤的診斷、治療和預后提供了新的思路和治療靶點。本文于20224月發(fā)表于“Molecular Therapy Nucleic Acids”IF=8.886)上。


技術路線

 


結果

1DDX11-AS1在膠質瘤組織中上調,高表達的DDX11-AS1與膠質瘤患者預后不良相關

為了探索DDX11-AS1在膠質瘤組織中的表達模式,我們在GEPIA網站上對TCGA數(shù)據(jù)進行了深入分析。由于TCGA數(shù)據(jù)中沒有膠質瘤對照組織樣本,通過匹配GTEx數(shù)據(jù),518例低級別膠質瘤(LGG)和163例膠質母細胞瘤(GBM)中DDX11-AS1的表達與207例正常樣本相比顯著增加(圖1A)。隨著級別的增加,表達水平也逐漸增加(圖1B)。通過對GSE4290數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)分析,我們發(fā)現(xiàn)DDX11-AS1在膠質瘤組織中也高表達(圖1C)。此外,我們收集了26個正常樣本和88個膠質瘤,通過實時定量PCR進行DDX11-AS1定量分析,結果與數(shù)據(jù)庫分析一致(圖1D)。根據(jù)DDX11-AS1表達水平均勻分布所有膠質瘤樣本后,我們發(fā)現(xiàn)DDX11-AS1低表達組的總體生存率和無病生存率較高,尤其是在5年內(圖1E1F)。基于TCGAGTEx膠質瘤數(shù)據(jù)的ROC曲線顯示,DDX11-AS1在預測膠質瘤患者預后方面具有較高的準確性(圖1G)。通過分析CGGA數(shù)據(jù)庫,我們還發(fā)現(xiàn)DDX11-AS1低表達的患者預后更好(圖1H)。這些結果表明,DDX11-AS1與膠質瘤的進展有關。



2DDX11-AS1促進膠質瘤細胞遷移和EMT過程

接下來,我們構建了敲低和過表達的DDX11-AS1細胞模型,用于細胞功能實驗。通過transwell和傷口愈合實驗,我們觀察到低表達DDX11-AS1的膠質瘤細胞的遷移能力減弱,而高表達膠質瘤細胞的遷移能力增強(圖2A2B)。此外,DDX11-AS1敲除細胞中E-鈣粘蛋白的表達增加,N-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達減少(圖2C)。這意味著DDX11-AS1基因敲除抑制了EMT過程;相反,DDX11-AS1過表達激活了EMT過程(圖2D)。



3DDX11-AS1增強膠質瘤細胞在體內外的增殖能力

為了研究DDX11-AS1對細胞增殖的影響,我們進行了體內和體外實驗。MTT試驗結果表明,敲除DDX11-AS1后,T98GHS683細胞的增殖能力下降(圖3A)。DDX11-AS1敲除細胞的集落形成顯著減少,DDX11-AS1高表達細胞的集落形成增加(圖3B)。此外,流式細胞術分析顯示,低表達DDX11-AS1的膠質瘤細胞數(shù)量增加(圖3C)。此外,我們還進行了體內腫瘤形成實驗。我們將DDX11-AS1過表達的HS683細胞皮下接種于裸鼠腋窩。腫瘤生長如圖3D所示。DDX11-AS1過表達細胞的生長速度更快。IHC結果顯示,Ki67在過表達組的表達水平增加(圖3E)。由于Wnt/b-cateninAKT途徑與膠質瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關。我們通過western blot觀察到DDX11-AS1敲除抑制了這兩條途徑,而過表達激活了這兩條途徑(圖3F3G)。IHC分析還顯示,DDX11-AS1組的b-連環(huán)蛋白表達增加(圖3E)。因此,DDX11-AS1促進了膠質瘤的發(fā)生和發(fā)展。



4DDX11-AS1HNRNPC相互作用

越來越多的研究表明,細胞質中lncRNA對細胞功能的調節(jié)依賴于蛋白質。因此,為了探索DDX11-AS1的潛在結合蛋白,我們預測了DDX11-AS1starBase v.2.0上的結合RBP,結果表明DDX11-AS1可以結合43RBP。此外,收集T98G細胞,通過RNA純化和質譜分析分離染色質,鑒定DDX11-AS1結合的蛋白質。與對照組相比,DDX11-AS1特異性結合208種蛋白質。我們主要關注iBAQ得分前50名的蛋白質。在兩組蛋白質相交后,只有HNRNPCPTBP1(圖4A)。由于HNRNPCDDX11AS1的相互作用更為豐富,HNRNPC被列為后續(xù)機制研究的候選分子。為了驗證DDX11-AS1HNRNPC的直接結合,我們使用HNRNPC抗體進行了RIP實驗,以拉下與HNRNPC結合的RNA分子。通過定量實時PCR檢測和分析,與IgG Ctrl組相比,HNRNPC抗體顯著富集DDX11-AS1(圖4B)。此外,我們還分析了TCGACGGA數(shù)據(jù)庫中DDX11-AS1HNRNPC表達之間的相關性。DDX11-AS1HNRNPC呈正相關(圖4C4D)。我們還發(fā)現(xiàn),HNRNPC在膠質瘤組織中高表達,HNRNPC低表達的患者預后更好(圖4E–4G)。通過western blot分析,HNRNPC的表達隨著DDX11-AS1的敲除而降低,HNRNPC的表達隨著DDX11-AS1的過表達而增加(圖4H4I)。此外,我們構建了三個用于HNRNPC敲除的siRNA,第三個序列是最好的敲除序列,然后用于后續(xù)實驗(圖4J)。總之,這些數(shù)據(jù)表明DDX11-AS1可以特異性結合HNRNPC。



5HNRNPC敲除抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和EMT

我們探討了HNRNPC在膠質瘤中的功能作用。敲除HNRNPC后,克隆形成實驗表明膠質瘤細胞的增殖能力下降(圖5A),傷口愈合實驗表明膠質瘤細胞遷移減少(圖5B)。這些結果表明,HNRNPC敲除抑制了膠質瘤細胞的增殖和遷移。此外,我們還發(fā)現(xiàn)HNRNPC影響Wnt/b-cateninAKT途徑以及EMT過程(圖5C)。



6DDX11-AS1通過HNRNPC促進膠質瘤進展

我們試圖探討DDX11-AS1對膠質瘤進展的影響是否依賴于HNRNPC。在過表達DDX11-AS1的基礎上,我們進一步敲除HNRNPC進行細胞增殖和遷移實驗。我們觀察到,通過敲除HNRNPCDDX11-AS1促進膠質瘤細胞增殖和遷移的能力減弱(圖6A6B)。此外,我們還分析了DDX11-AS1/HNRNPC軸在體內的作用。結果表明,HNRNPC敲除減弱了DDX11-AS1對膠質瘤生長的促進作用(圖6C)。western blot分析表明,HNRNPC敲除降低了DDX11-AS1介導的Wnt/b-cateninAKT途徑的激活,以及EMT過程(圖6D)。此外,根據(jù)DDX11-AS1HNRNPCCGGA膠質瘤患者中的表達情況,將患者分為四組進行總體生存分析。如圖6E所示,DDX11-AS1HNRNPC低表達的患者生存率最高。



結論:DDX11-AS1在膠質瘤組織中上調,并與膠質瘤患者的預后不良相關。在機制上,DDX11-AS1HNRNPC的結合增強了Wnt/b-cateninAKT途徑以及EMT,從而促進膠質瘤細胞的增殖和遷移。DDX11-AS1/HNRNPC軸的發(fā)現(xiàn)有望為膠質瘤的診斷和預后提供新的思路。


參考文獻:

Xiang Z, Lv Q, Zhang Y, Chen X, Guo R, Liu S, Peng X. Long non-coding RNA DDX11-AS1 promotes the proliferation and migration of glioma cells by combining with HNRNPC. Mol Ther Nucleic Acids. 2022, 28:601-612. doi: 10.1016/j.omtn.2022.04.016.