lncRNA DDX11-AS1通過與HNRNPC結(jié)合促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖和遷移

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病機制復雜，手術難度大，術后復發(fā)率高。目前，仍然缺乏有效的治療。lncRNA DDX11-AS1已被證明可促進腫瘤的發(fā)展，如肝細胞癌、食管癌等。然而，其在膠質(zhì)瘤中的分子機制尚不清楚。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織中DDX11-AS1的表達升高，DDX11-AS1高表達的患者預后不良。DDX11-AS1是一個潛在的預后標志物。在功能上，DDX11-AS1促進膠質(zhì)瘤細胞增殖和遷移。在機制上，DDX11-AS1與HNRNPC相互作用，促進Wnt /b-catenin和AKT途徑以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。綜上所述， DDX11-AS1/HNRNPC軸可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關重要的作用，這為膠質(zhì)瘤的診斷、治療和預后提供了新的思路和治療靶點。本文于2022年4月發(fā)表于“Molecular Therapy Nucleic Acids”（IF=8.886）上。

技術路線

結(jié)果

1）DDX11-AS1在膠質(zhì)瘤組織中上調(diào)，高表達的DDX11-AS1與膠質(zhì)瘤患者預后不良相關

為了探索DDX11-AS1在膠質(zhì)瘤組織中的表達模式，我們在GEPIA網(wǎng)站上對TCGA數(shù)據(jù)進行了深入分析。由于TCGA數(shù)據(jù)中沒有膠質(zhì)瘤對照組織樣本，通過匹配GTEx數(shù)據(jù)，518例低級別膠質(zhì)瘤（LGG）和163例膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）中DDX11-AS1的表達與207例正常樣本相比顯著增加（圖1A）。隨著級別的增加，表達水平也逐漸增加（圖1B）。通過對GSE4290數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)分析，我們發(fā)現(xiàn)DDX11-AS1在膠質(zhì)瘤組織中也高表達（圖1C）。此外，我們收集了26個正常樣本和88個膠質(zhì)瘤，通過實時定量PCR進行DDX11-AS1定量分析，結(jié)果與數(shù)據(jù)庫分析一致（圖1D）。根據(jù)DDX11-AS1表達水平均勻分布所有膠質(zhì)瘤樣本后，我們發(fā)現(xiàn)DDX11-AS1低表達組的總體生存率和無病生存率較高，尤其是在5年內(nèi)（圖1E和1F）?；?/span>TCGA和GTEx膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)的ROC曲線顯示，DDX11-AS1在預測膠質(zhì)瘤患者預后方面具有較高的準確性（圖1G）。通過分析CGGA數(shù)據(jù)庫，我們還發(fā)現(xiàn)DDX11-AS1低表達的患者預后更好（圖1H）。這些結(jié)果表明，DDX11-AS1與膠質(zhì)瘤的進展有關。

2）DDX11-AS1促進膠質(zhì)瘤細胞遷移和EMT過程

接下來，我們構(gòu)建了敲低和過表達的DDX11-AS1細胞模型，用于細胞功能實驗。通過transwell和傷口愈合實驗，我們觀察到低表達DDX11-AS1的膠質(zhì)瘤細胞的遷移能力減弱，而高表達膠質(zhì)瘤細胞的遷移能力增強（圖2A和2B）。此外，DDX11-AS1敲除細胞中E-鈣粘蛋白的表達增加，N-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達減少（圖2C）。這意味著DDX11-AS1基因敲除抑制了EMT過程；相反，DDX11-AS1過表達激活了EMT過程（圖2D）。

3）DDX11-AS1增強膠質(zhì)瘤細胞在體內(nèi)外的增殖能力

為了研究DDX11-AS1對細胞增殖的影響，我們進行了體內(nèi)和體外實驗。MTT試驗結(jié)果表明，敲除DDX11-AS1后，T98G和HS683細胞的增殖能力下降（圖3A）。DDX11-AS1敲除細胞的集落形成顯著減少，DDX11-AS1高表達細胞的集落形成增加（圖3B）。此外，流式細胞術分析顯示，低表達DDX11-AS1的膠質(zhì)瘤細胞數(shù)量增加（圖3C）。此外，我們還進行了體內(nèi)腫瘤形成實驗。我們將DDX11-AS1過表達的HS683細胞皮下接種于裸鼠腋窩。腫瘤生長如圖3D所示。DDX11-AS1過表達細胞的生長速度更快。IHC結(jié)果顯示，Ki67在過表達組的表達水平增加（圖3E）。由于Wnt/b-catenin和AKT途徑與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關。我們通過western blot觀察到DDX11-AS1敲除抑制了這兩條途徑，而過表達激活了這兩條途徑（圖3F和3G）。IHC分析還顯示，DDX11-AS1組的b-連環(huán)蛋白表達增加（圖3E）。因此，DDX11-AS1促進了膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展。

4）DDX11-AS1與HNRNPC相互作用

越來越多的研究表明，細胞質(zhì)中lncRNA對細胞功能的調(diào)節(jié)依賴于蛋白質(zhì)。因此，為了探索DDX11-AS1的潛在結(jié)合蛋白，我們預測了DDX11-AS1在starBase v.2.0上的結(jié)合RBP，結(jié)果表明DDX11-AS1可以結(jié)合43個RBP。此外，收集T98G細胞，通過RNA純化和質(zhì)譜分析分離染色質(zhì)，鑒定DDX11-AS1結(jié)合的蛋白質(zhì)。與對照組相比，DDX11-AS1特異性結(jié)合208種蛋白質(zhì)。我們主要關注iBAQ得分前50名的蛋白質(zhì)。在兩組蛋白質(zhì)相交后，只有HNRNPC和PTBP1（圖4A）。由于HNRNPC與DDX11AS1的相互作用更為豐富，HNRNPC被列為后續(xù)機制研究的候選分子。為了驗證DDX11-AS1與HNRNPC的直接結(jié)合，我們使用HNRNPC抗體進行了RIP實驗，以拉下與HNRNPC結(jié)合的RNA分子。通過定量實時PCR檢測和分析，與IgG Ctrl組相比，HNRNPC抗體顯著富集DDX11-AS1（圖4B）。此外，我們還分析了TCGA和CGGA數(shù)據(jù)庫中DDX11-AS1和HNRNPC表達之間的相關性。DDX11-AS1與HNRNPC呈正相關（圖4C和4D）。我們還發(fā)現(xiàn)，HNRNPC在膠質(zhì)瘤組織中高表達，HNRNPC低表達的患者預后更好（圖4E–4G）。通過western blot分析，HNRNPC的表達隨著DDX11-AS1的敲除而降低，HNRNPC的表達隨著DDX11-AS1的過表達而增加（圖4H，4I）。此外，我們構(gòu)建了三個用于HNRNPC敲除的siRNA，第三個序列是最好的敲除序列，然后用于后續(xù)實驗（圖4J）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明DDX11-AS1可以特異性結(jié)合HNRNPC。

5）HNRNPC敲除抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移和EMT

我們探討了HNRNPC在膠質(zhì)瘤中的功能作用。敲除HNRNPC后，克隆形成實驗表明膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力下降（圖5A），傷口愈合實驗表明膠質(zhì)瘤細胞遷移減少（圖5B）。這些結(jié)果表明，HNRNPC敲除抑制了膠質(zhì)瘤細胞的增殖和遷移。此外，我們還發(fā)現(xiàn)HNRNPC影響Wnt/b-catenin和AKT途徑以及EMT過程（圖5C）。

6）DDX11-AS1通過HNRNPC促進膠質(zhì)瘤進展

我們試圖探討DDX11-AS1對膠質(zhì)瘤進展的影響是否依賴于HNRNPC。在過表達DDX11-AS1的基礎上，我們進一步敲除HNRNPC進行細胞增殖和遷移實驗。我們觀察到，通過敲除HNRNPC，DDX11-AS1促進膠質(zhì)瘤細胞增殖和遷移的能力減弱（圖6A和6B）。此外，我們還分析了DDX11-AS1/HNRNPC軸在體內(nèi)的作用。結(jié)果表明，HNRNPC敲除減弱了DDX11-AS1對膠質(zhì)瘤生長的促進作用（圖6C）。western blot分析表明，HNRNPC敲除降低了DDX11-AS1介導的Wnt/b-catenin和AKT途徑的激活，以及EMT過程（圖6D）。此外，根據(jù)DDX11-AS1和HNRNPC在CGGA膠質(zhì)瘤患者中的表達情況，將患者分為四組進行總體生存分析。如圖6E所示，DDX11-AS1和HNRNPC低表達的患者生存率最高。

結(jié)論：DDX11-AS1在膠質(zhì)瘤組織中上調(diào)，并與膠質(zhì)瘤患者的預后不良相關。在機制上，DDX11-AS1和HNRNPC的結(jié)合增強了Wnt/b-catenin和AKT途徑以及EMT，從而促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖和遷移。DDX11-AS1/HNRNPC軸的發(fā)現(xiàn)有望為膠質(zhì)瘤的診斷和預后提供新的思路。

參考文獻：

Xiang Z, Lv Q, Zhang Y, Chen X, Guo R, Liu S, Peng X. Long non-coding RNA DDX11-AS1 promotes the proliferation and migration of glioma cells by combining with HNRNPC. Mol Ther Nucleic Acids. 2022, 28:601-612. doi: 10.1016/j.omtn.2022.04.016.