CircVAPA通過調(diào)控miR - 3773p和miR - 4943p /IGF1R/AKT軸促進(jìn)小細(xì)胞肺癌進(jìn)展

小細(xì)胞肺癌(SCLC)是一種具有高度侵襲性和致命性的肺癌亞型，盡管化療取得了顯著進(jìn)展，但SCLC患者幾乎在一年內(nèi)復(fù)發(fā)，預(yù)后相當(dāng)差，5年生存率低于7%。多項(xiàng)證據(jù)表明，circRNAs (circRNAs)在各種人類癌癥中發(fā)揮致癌或抑制腫瘤的作用。然而，circRNA在小細(xì)胞肺癌(SCLC)中的生物學(xué)功能仍不明確。為了闡明circRNA在SCLC腫瘤發(fā)生中的功能，對(duì)SCLC組織和SCLC患者血清中差異表達(dá)的circRNAs進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1、 circVAPA在SCLC中的鑒定

基于之前已報(bào)道的SCLC中CircRNA表達(dá)模式和以及118名正常人和SCLC患者RNA-seq數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)circVAPA是一種顯著上調(diào)的circRNA(Fig. 1A)。分析circVAPA在肺癌細(xì)胞系和人原發(fā)性SCLC組織中的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，3對(duì)SCLC組織中內(nèi)源性circVAPA顯著升高(Fig. 1C)。同樣，circVAPA在SCLC細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于NSCLC細(xì)胞系(Fig.1D)，提示circVAPA是SCLC中顯著上調(diào)的circRNA，值得進(jìn)一步研究。DMS273和H82細(xì)胞系中circVAPA表達(dá)水平最高，于是選擇了SCLC細(xì)胞系DMS273和H82進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。circBase數(shù)據(jù)庫(kù)顯示CircVAPA從vamp相關(guān)蛋白A (VAPA)基因的2-4外顯子反剪接而來，全長(zhǎng)338個(gè)核苷酸(nt)。 VAPA基因外顯子2-4的環(huán)狀化通過頭尾連接形成了circVAPA。用RT-PCR驗(yàn)證circVAPA的存在(Fig. 1E)。RT-qPCR檢測(cè)RNase R外切酶，證實(shí)circVAPA耐消化(Fig. 1F, G), 符合circRNA的特征。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)circVAPA的穩(wěn)定性，放線菌素D(一種轉(zhuǎn)錄抑制劑)處理實(shí)驗(yàn)顯示，在SCLC細(xì)胞中，circVAPA比VAPA mRNA更穩(wěn)定(Fig. 1H, I)。以circVAPA后接位點(diǎn)為靶點(diǎn)的FISH檢測(cè)和對(duì)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)RNA的qPCR分析顯示，在DMS273和H82細(xì)胞中，circVAPA均在細(xì)胞質(zhì)中富集(Fig. 1J, K)。

Fig1 circVAPA在SCLC中的鑒定

2、CircVAPA在體外促進(jìn)SCLC進(jìn)展

兩個(gè)針對(duì)circVAPA后剪接位點(diǎn)的獨(dú)立siRNA導(dǎo)致了SCLC細(xì)胞中circVAPA的有效沉默，而VAPA mRNA沒有顯著變化(Fig. 2A)。CTG熒光實(shí)驗(yàn)顯示，circVAPA被任一siRNA敲低都會(huì)降低SCLC細(xì)胞的活力(Fig. 2B)。隨后，siRNA介導(dǎo)的circVAPA抑制導(dǎo)致SCLC細(xì)胞集落形成減少(Fig. 2C)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，circVAPA耗盡導(dǎo)致SCLC細(xì)胞G0/G1周期阻滯，SCLC細(xì)胞凋亡比例增加(Fig 2D,E)。同時(shí)，WB檢測(cè)的SCLC細(xì)胞中，circVAPA敲低后p21和cleaved PARP蛋白水平顯著升高(Fig 2F).

Fig 2 circVAPA干擾抑制SCLC細(xì)胞集落形成

3、CircVAPA在體外促進(jìn)SCLC進(jìn)展

此外，作者構(gòu)建了過表達(dá)的circVAPA (OE-circVAPA)。如圖3A所示，OE-circVAPA顯著增加了circVAPA的表達(dá)，且沒有改變SCLC細(xì)胞中VAPA mRNA水平的變化。與circVAPA沉默的效果相反，過表達(dá)circVAPA有助于SCLC細(xì)胞的細(xì)胞活力、集散形成和細(xì)胞周期進(jìn)程的增加，凋亡細(xì)胞比例和p21和cleaved PARP蛋白水平的降低(Fig 3B-F)?？偟膩碚f，作者的結(jié)果得出的結(jié)論是，circVAPA促進(jìn)了體外SCLC進(jìn)展。

Fig 3 CircVAPA在體外促進(jìn)SCLC進(jìn)展

4、CircVAPA是miR - 3773p和miR - 4943p的海綿

采用Ago2 RNA免疫沉淀(RIP)驗(yàn)證circVAPA在DMS273細(xì)胞中的結(jié)合(Fig 4A)。RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)Ago2與circVAPA和circHIPK3(陽(yáng)性對(duì)照)直接結(jié)合，而與EIciPAIP2(陰性對(duì)照)不結(jié)合(Fig 4B)。

然后作者使用了CircInteractome來預(yù)測(cè)circVAPA假定的miRNA結(jié)合位點(diǎn)。如圖4C所示，circVAPA序列中預(yù)測(cè)了14個(gè)假定的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，其中，miR-494-3p有兩個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)。然后，合成了circVAPA連接位點(diǎn)反義的生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針，并進(jìn)行RNA下拉實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證明miRNA-circVAPA可能存在相互作用(Fig. 4D)。與對(duì)照探針相比，反義探針能夠有效且精確地捕獲內(nèi)源性circVAPA，并下拉的miR-377-3p和miR-494-3p，但沒有其他12種預(yù)測(cè)miRNAs(Fig. 4E)。此外，Ago2 RIP的RT-qPCR分析表明，在DMS273細(xì)胞中，miR-377-3p或miR-494-3p與相應(yīng)的mimic過表達(dá)后，circVAPA富集顯著(Fig. 4F)。此外，作者構(gòu)建了熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，將circVAPA的線性序列或假設(shè)的miR-377-3p或miR-494-3p結(jié)合位點(diǎn)突變的序列融合到熒光素酶的3 ' UTR上。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了293T細(xì)胞中circVAPA與miR-377-3p/miR-494-3p的直接結(jié)合(Fig. 4G)。值得注意的是，circVAPA中兩個(gè)假定的miR-494-3p結(jié)合位點(diǎn)對(duì)它們的相互作用都是必需的(Fig. 4G)。在siRNA介導(dǎo)的circVAPA敲低后，DMS273和H82細(xì)胞中miR-377-3p和miR-494-3p的表達(dá)水平顯著升高，而circVAPA過表達(dá)導(dǎo)致miR-377-3p和miR-494-3p的水平下降(Fig.4)。

重要的是，作者證明了抑制miR-circVAPA衰竭細(xì)胞中的377-3p或miR-494-3p可以挽救circVAPA敲低對(duì)DMS273和H82細(xì)胞活力和集落形成的抑制作用(Fig. 4H, I)。相反，miR-377-3p或miR-494-3p過表達(dá)消除了circVAPA過表達(dá)對(duì)DMS273和H82細(xì)胞活力和集落形成的促進(jìn)作用(Fig.4J, K)。這些結(jié)果表明，circVAPA在SCLC細(xì)胞中充當(dāng)了miR-377-3p和miR-494-3p的分子海綿。377-3p或miR-494-3p過表達(dá)消除了circVAPA的促進(jìn)作用。

        Fig4 CircVAPA是miR - 3773p和miR - 4943p的海綿

5、IGF1R是miR - 3773p和miR - 4943p的功能靶標(biāo)

由于circVAPA可以作為ceRNA作用于miR-377-3p和miR-494-3p，作者開始確定miRNA的下游靶點(diǎn)。通過兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-377-3p和miR-494-3p的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-377-3p和miR-494-3p共享41個(gè)共同候選基因(Fig. 5A）。對(duì)數(shù)據(jù)集(GSE149507)和41個(gè)常見候選SCLC中顯著上調(diào)的靶基因進(jìn)行整合分析，最終聚焦于10個(gè)潛在靶基因。IGF1R是SCLC中不可或缺的角色，進(jìn)一步證實(shí)發(fā)現(xiàn)它是miR-377-3p和miR-494-3p的唯一共同靶點(diǎn)，轉(zhuǎn)染miR-377-3p/miR-494-3p模擬物和抑制劑。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，作者進(jìn)一步揭示了miR-377-3p/miR-494-3p在分子水平與野生型IGF1R mRNA結(jié)合，但在293T細(xì)胞中miR-377-3p/miR-494-3p的假設(shè)結(jié)合位點(diǎn)未與攜帶突變的IGF1R mRNA結(jié)合(Fig. 5B, C)。值得注意的是，只有位點(diǎn)2挽救了miR-494-3p誘導(dǎo)的熒光素酶活性抑制作用(Fig.5C)。接下來，作者檢測(cè)了miR-377-3p/miR-494-3p和IGF1R的表達(dá)，SCLC臨床標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)miR-377-3p/miR-與paraSCLC相比，SCLC中494-3p均下調(diào)，而IGF1R mRNA則呈現(xiàn)相反趨勢(shì)(Fig.5D, E)。

此外，沉默miR -377-3p/miR-494-3p及其相應(yīng)的抑制劑在mRNA和蛋白水平上顯著提高了DMS273和H82細(xì)胞中IGF1R的表達(dá)(Fig.5F, H和Fig.6A)。相反，miR-377-3p和miR-494-3p及其模擬物過表達(dá)顯著降低了SCLC細(xì)胞中IGF1R的mRNA和蛋白水平(Fig.5G、I，Fig.6B)。這些結(jié)果表明，IGF1R是miR-377-3p和miR-494-3p的直接和功能靶點(diǎn)。

Fig 5 IGF1R是miR-377-3p和miR-494-3p的直接和功能靶點(diǎn)。

6、CircVAPA通過miR - 3773p & miR - 4943p /IGF1R/AKT軸促進(jìn)SCLC細(xì)胞活力

為了檢測(cè)circVAPA是否作為靶向miR-377-3p和miR-494-3p的ceRNA來調(diào)控IGF1R的表達(dá)水平，作者采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來評(píng)估circVAPA與miR-377-3p和miR-494-3p以及IGF1R之間的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，異位circVAPA過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-377-3p和miR-494-3p過表達(dá)對(duì)熒光素酶活性的抑制，表明在circVAPA作為ceRNA對(duì)抗miR-377-3p和miR-494-3p，解除對(duì)IGF1R表達(dá)的抑制(Fig. 6E）。

接下來探索circVAPA是否通過miR-377-3p和miR-494-3p/IGF1R軸調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)SCLC進(jìn)展。首先，作者證明了S6核糖體蛋白(p-S6RP) ，miR-377-3p或miR-494-3p抑制劑可以挽救IGF1R及其下游靶點(diǎn)磷酸化AKT (p-AKT)和磷酸化的S6核糖體蛋白(p-S6RP) 的mRNA和蛋白水平的下降(Fig. 5F, H，Fig. 6A）。值得注意的是，根據(jù)作者之前報(bào)道的研究，在H82細(xì)胞中，p-AKT水平太低，無法通過western blot檢測(cè)到。相反，circVAPA對(duì)IGF1R mRNA、IGF1R蛋白、p-AKT和p-S6RP蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用可以被miR-377-3p或miR-494-3p模擬物消除(Fig. 5G, I ,Fig. 6B)。重要的是，IGF1R已被證明是一個(gè)潛在的靶點(diǎn)，并抑制IGF1R在SCLC細(xì)胞中表達(dá)，表現(xiàn)出良好的抗腫瘤作用。通過siRNA或BMS-536924抑制IGF1R抑制劑，能恢復(fù)circvapa誘導(dǎo)的細(xì)胞活力、集散形成、IGF1R mRNA以及IGF1R、p-AKT和p-S6RP的蛋白水平(Fig. 5J-L, Fig. 6C, D)。 IHC染色顯示，與paraSCLC相比，SCLC中IGF1R和p-AKT蛋白水平均上調(diào)(Fig. 6F, G)。綜合這些結(jié)果表明，circVAPA通過隔離miR-377-3p和miR-494-3p激活IGF1R/AKT軸促進(jìn)SCLC細(xì)胞活力和集合體形成。

Fig6 CircVAPA通過miR - 3773p & miR - 4943p /IGF1R/AKT軸促進(jìn)SCLC細(xì)胞活力

7、CircVAPA通過調(diào)控IGF1R在體內(nèi)和體外促進(jìn)SCLC增殖

BMS-536924，一種靶向IGF1R的小分子抑制劑，已被證實(shí)可以抑制IGF1R磷酸化并阻斷IGF1R介導(dǎo)的AKT信號(hào)級(jí)聯(lián)。添加BMS-536924可以減弱p-AKT和p-S6RP蛋白的表達(dá)，但這種對(duì)AKT信號(hào)級(jí)聯(lián)的負(fù)調(diào)控在circVAPA過表達(dá)時(shí)減弱(Fig 6d)。此外，作者用慢病毒shRNA建立了DMS273穩(wěn)定細(xì)胞系來沉默circVAPA。添加BMS-536924或抑制circVAPA的處理對(duì)AKT信號(hào)級(jí)聯(lián)的降低顯示出中等的影響，而兩者的聯(lián)合處理顯示出最大的抑制效果(Fig. 7A)。為了支持WB結(jié)果，單獨(dú)添加BMS-536924或沉默circVAPA對(duì)DMS273和H82的細(xì)胞活力和克隆形成有明顯的阻斷作用(Fig. 7B, C)。然而，聯(lián)合使用BMS-536924處理和減少circVAPA對(duì)DMS273和H82的細(xì)胞活力和克隆形成有最大的抑制作用(Fig.7B, C)。

為了探討circVAP在SCLC體內(nèi)的生物學(xué)功能，然后作者進(jìn)行皮下注射circVAPA敲除和對(duì)照DMS273細(xì)胞裸鼠，以研究circVAPA在體內(nèi)的作用。與對(duì)照組相比，circVAPA穩(wěn)定敲除的細(xì)胞形成的腫瘤體積、體積和重量都明顯更小(Fig.7D-F)。免疫組化染色顯示，與對(duì)照組相比，來自circVAPA穩(wěn)定敲低的細(xì)胞的腫瘤中Ki67、IGF1R、p-AKT水平顯著降低 (Fig.7G)。IGF1R抑制劑BMS-536924在體外表現(xiàn)出增強(qiáng)了circVAPA沉默引起的對(duì)細(xì)胞活力、集散形成、p-AKT和p-S6RP的抑制作用，以及體內(nèi)腫瘤大小、體積和重量的抑制作用，表明BMS-536924和circVAPA損耗可能在SCLC治療中實(shí)現(xiàn)潛在的協(xié)同作用(Fig.7A-G)。這些結(jié)果表明，在體內(nèi)，circVAPA通過靶向IGF1R，促進(jìn)SCLC增殖體內(nèi)。

Fig7 CircVAPA通過調(diào)控IGF1R在體內(nèi)和體外促進(jìn)SCLC增殖

總之，本研究提出circVAPA/miR-377-3p和miR-494-3p/IGF1R/AKT軸可能是SCLC的一個(gè)有效治療靶點(diǎn)，為SCLC進(jìn)展的機(jī)制提供新的見解。