空間代謝組——脂質(zhì)組：16.2高分揭示二級保護動物洞穴魚的脂質(zhì)代謝進化

Sinocyclocheilus 是中國特有的稀有淡水硬骨魚屬，包括河棲的地表魚和洞穴魚。利用定量脂質(zhì)組和空間質(zhì)譜圖像（MSI）相結(jié)合的方法，本文發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)分布和脂質(zhì)代謝的神經(jīng)區(qū)隔化與Sinocyclocheilus的進化有關(guān)。本研究于2022年4月發(fā)表在《Molecular Biology and Evolution》IF：16.240。

技術(shù)路線：

主要研究內(nèi)容：

1、洞穴魚腦內(nèi)氧化磷酸化增加

2016年至2018年在云南省昆明市附近野外捕獲Sinocyclocheilus (2020年被申報為國家二級保護動物)。在南盤江沿岸的一個洞穴中發(fā)現(xiàn)了洞穴魚品種 S. anophthalmus，而在黃泥河沿岸發(fā)現(xiàn)了地表魚品種S. anophthalmus（圖1A）。利用之前發(fā)表的全腦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用GSEA來研究這兩個物種之間KEGG通路的差異。GSEA顯示洞穴魚腦內(nèi)花生四烯酸(ARA)代謝和氧化磷酸化較地表魚明顯增強（圖1B）。然后分析了兩個品種的整個腦的脂質(zhì)組，PCA顯示洞穴魚和地表魚的腦脂質(zhì)組明顯區(qū)分開（圖1C）。主要脂類的聚類熱圖顯示在地表魚的大腦中復雜的糖鞘脂豐度顯著升高（圖1D）。為探究脂質(zhì)相關(guān)性的整體改變，對洞穴魚和地表魚的全腦脂質(zhì)組進行脂質(zhì)相關(guān)性分析。如圖1E所示，兩個品種魚的脂質(zhì)關(guān)聯(lián)發(fā)生明顯改變。

圖1洞穴魚和地表魚全腦轉(zhuǎn)錄組和脂質(zhì)組的變化

2、洞穴魚和地表魚的神經(jīng)元表現(xiàn)出相反的DHA和ARA模式

腦切片根據(jù)其沿縱軸的位置分為四個主要腦區(qū)，即端腦（Tel）、視頂蓋（TeO）、小腦（CC）和延髓（MO）。硬骨動物血清素能神經(jīng)元主要分布在后腦中縫核和位于前腦的三個下丘腦核中，而哺乳動物中不存在下丘腦核（圖2A）。定量脂質(zhì)組揭示了地表魚的整個大腦的四個區(qū)域中含有的ARAs膜磷脂都少于洞穴魚（圖2B-2C）。洞穴魚中富集的ARAs膜磷脂和前面GSEA的結(jié)果，表明ARA代謝增強。相反，其他脂類表現(xiàn)出區(qū)域特異性變化，這只有在區(qū)域特異性脂質(zhì)體組學中才變得明顯。例如，洞穴魚的TeO和CC中的?；鈮A水平與地表魚相比明顯升高（圖2C-2D）。有趣的是，與ARA相反，洞穴魚的TeO和CC中的自由二十二碳六烯酸(DHA)水平比地表魚顯著降低（圖2D）。與表面魚相比，洞穴魚的 TeO 和 CC 區(qū)域的主要 DHA 磷脂（包括 PC 38:6、PC 40:6 和 PE 40:6）也減少了。

圖2 洞穴魚和地表魚四個腦區(qū)脂質(zhì)的區(qū)域特異性變化

定量脂質(zhì)組學、MSI的腦切片說明 ARA 磷脂，例如 PC 36:4 和 PC 38:4（磷脂酰膽堿，PCs）在 TeO、CC 和 MO 地區(qū)的洞穴魚切片中持續(xù)增加（圖3）。另一方面，洞穴魚體內(nèi)的DHA磷脂，如PC 40:6、PC 38:6和PE 40:6，與地表魚相比明顯減少（圖3）。事實上，敲除一個主要的助推超家族成員，Mfsd2a，被證明是DHA通過血腦屏障進入小鼠大腦的轉(zhuǎn)運體，導致小腦中的浦kinje細胞大量丟失（圖3）。因此，DHA可能對地表魚的小腦功能至關(guān)重要，而這在洞穴魚的進化中可能不那么重要了。相對于洞穴魚，DHA -磷脂的富集延伸到地表魚的眼睛和肝臟，在地表魚中，DHA-PCs 的顯著簇含量較高（圖4）。至于 ARA 磷脂，它們在洞穴魚中的富集位于退化視葉的腦室周圍灰色區(qū)域（圖3）。

圖3洞穴魚和地表魚四個腦區(qū)脂質(zhì)空間分布的質(zhì)譜成像

ARA-相對于 DHA-磷脂的優(yōu)先積累也在洞穴魚的全眼和全肝樣本中得到驗證，相對于它們的表面棲息對應(yīng)物（圖4）。ARA包含的磷脂，包括磷脂酰絲氨酸PS 38:4(18:0_20:4)和磷脂酰肌醇PI36:4(16:0_20:4) 都是最顯著不同的脂質(zhì)，其在洞穴魚眼(CE)中含量高于表面魚眼(SE)（圖4A）。在洞穴魚的眼睛和肝臟中，與地表魚相比，ARA-PC 簇明顯富集（圖4C）。

圖4洞穴魚和地表魚全眼和全肝脂質(zhì)的變化

3、穴居魚的中縫血清素激活的神經(jīng)元發(fā)生脫髓鞘

基于區(qū)域特異性脂質(zhì)組學，注意到，相對于洞穴魚，地表魚的TeO、CC和MO區(qū)域的硫化物(SLs)顯著升高（圖2B-D）。MSI 顯示，表層魚 TeO中的 SL 富集（SL t42:1、SL t44:1）位于后結(jié)節(jié)，富含來自上中縫血清素能群體的神經(jīng)元投射（圖 3）。相比之下，相比之下，橫穿下丘腦血清素能神經(jīng)元的 TeO 切片的腦室周圍下丘腦背側(cè)區(qū)沒有可觀察到的 SL 信號，而是富含 DHA 磷脂（PE40:6、PC 40:6 和 PC 38:6)（圖 3）。同樣，在地表魚相對于洞穴魚的CC和MO切片的中間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)區(qū)域觀察到 SL 富集（圖 3），其中富含下縫血清素能神經(jīng)元的投射。髓磷脂分布的免疫染色，即髓磷脂堿性蛋白的紅色熒光信號與 MSI 數(shù)據(jù)一致。髓磷脂分布在空間上與SL信號重疊，對應(yīng)于CC中下縫血清素能神經(jīng)元和 TeO 上中縫血清素能神經(jīng)元，但在含有下丘腦血清素能神經(jīng)元的背側(cè)腦室周圍下丘腦中沒有。然后，通過使用TEM對軸突髓鞘形成成像來驗證基于脂質(zhì)組學和免疫染色的觀察結(jié)果（圖 5）。作者選擇后腦CC區(qū)域做TEM，因為該區(qū)域主要包含下中縫血清素能神經(jīng)支配，而不是下丘腦血清素能神經(jīng)支配。來自CC區(qū)域的代表性TEM圖像顯示，相對于洞穴魚，在地表魚視野中捕獲的單個軸突周圍有更多的髓鞘（圖 5A），以及較大的軸突周圍的髓鞘厚度更大（圖 5B和5C）。因此，基于MSI、免疫染色和TEM圖像檢查髓鞘形成程度，相對于洞穴魚，其似乎主要在地表魚后腦區(qū)域的中縫血清素能神經(jīng)元群體的髓鞘化程度更高。洞穴魚的中縫血清素能神經(jīng)元在其進化過程中可能經(jīng)歷了明顯的脫髓鞘。免疫染色也顯示，與地表魚相比，洞穴魚在 TeO 和 CC 區(qū)域具有更高水平的 5-HT 受體 4 (5-HTR4)（綠色熒光）（圖5D）。這些研究結(jié)果表明，相對于表面魚類，洞穴魚在它們的中縫血清素能神經(jīng)元中特別發(fā)生脫髓鞘，但在下丘腦血清素能神經(jīng)元中沒有。

圖5穴居魚的中縫血清素激活的神經(jīng)元發(fā)生脫髓鞘

4、魚類大腦和肝臟中環(huán)境特異性代謝適應(yīng)的基因表達

對洞穴魚的大腦、眼睛和肝臟與表面魚類的脂質(zhì)組學研究中，發(fā)現(xiàn)兩種魚類之間脂質(zhì)代謝的四個本質(zhì)差異，這可能與它們不同棲息地的不同選擇壓力有關(guān)。相對于地表魚類，洞穴魚表現(xiàn)出 1) 大腦中的氧化磷酸化增強； 2) DHA-磷脂在大腦、眼睛和肝臟中優(yōu)先于ARA-磷脂的積累； 3) 脂肪（以儲存 TAG 的形式）和縮醛磷脂 PC 在肝臟中的積累； (4) 后腦中縫血清素能神經(jīng)元的選擇性脫髓鞘作用。

為了闡明洞穴魚和表面魚之間差異脂質(zhì)代謝的候選基因，檢測了大腦和肝臟中幾個在 DHA 生物合成、攝取和磷脂重塑、脂肪動員、線粒體和過氧化物酶體β-氧化以及 plamalogen 途徑的基因表達。如圖6的qRT-PCR 顯示，在大腦中，DHA 生物合成途徑的fads2的表達在地表魚中顯著高于洞穴魚，但對于Sprecher途徑上的其他基因（elovl2、elovl5 、mfsd2a和acox1）則不然。相比之下，雖然洞穴魚和地表魚的肝臟中 fads2 的水平?jīng)]有顯著差異，但與洞穴魚相比，地表魚肝臟中的 Sprecher 途徑的其他基因（elovl2、elovl5 和 acox1）顯著升高。 根據(jù)結(jié)果，地表魚似乎通過 Δ4 去飽和酶途徑增加大腦中的 DHA 生物合成，但依賴于 Sprecher 途徑來增強肝臟中的 DHA 生物合成。 此外，介導DHA從體循環(huán)吸收到大腦的mfsd2a水平在洞穴魚和水面魚之間沒有顯著差異。因此，地表魚可能保留了局部的 DHA 神經(jīng)供應(yīng)來維持關(guān)鍵的大腦功能，而不是依賴于從體循環(huán)中攝取 DHA。

圖6洞穴魚和水面魚對不同棲息地代謝適應(yīng)的大腦和肝臟基因的mRNA表達

圖7的示意圖總結(jié)了洞穴魚和地表魚大腦和肝臟中主要的差異代謝途徑，揭示了它們對不同環(huán)境的代謝適應(yīng)。除了大腦，洞穴魚肝臟中的DHA脂質(zhì)也經(jīng)歷了類似的減少——肝臟是控制全身脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵器官。與大腦相比，洞穴魚肝臟中 DHA 生物合成的減少是由于沿 Sprecher 通路的流動減弱所致（圖 7）。這一觀察表明，DHA 生物合成能力的喪失可能在大腦之外具有進化意義。

圖7通過脂質(zhì)組學和qRT-PCR，該示意圖總結(jié)了洞穴魚和地表魚大腦和肝臟中主要的代謝途徑，揭示了它們對不同環(huán)境的代謝適應(yīng)

參考文獻：

Lam Sin Man., Li Jie., Sun Huan., Mao Weining., Lu Zongmin., Zhao Qingshuo., Han Chao., Gong Xia., Jiang Binhua., Chua Gek Huey., Zhao Zhenwen., Meng Fanwei., Shui Guanghou.(2022). Quantitative Lipidomics and Spatial MS-Imaging Uncovered Neurological and Systemic Lipid Metabolic Pathways Underlying Troglomorphic Adaptations in Cave-Dwelling Fish. Mol Biol Evol, 39(4), undefined. doi:10.1093/molbev/msac050