ALKBH5通過m6A-YTHDF2依賴性方式影響骨肉瘤的發(fā)展

m6A是最常見和最豐富的mRNA修飾，在許多生物過程中起著至關(guān)重要的作用。然而，作為一種關(guān)鍵的RNA去甲基酶，ALKBH5在人類骨肉瘤中的研究尚不充分。本研究旨在探討ALKBH5介導(dǎo)的m6A修飾及其在骨肉瘤中的潛在機(jī)制。我們的數(shù)據(jù)表明，ALKBH5的低表達(dá)與骨肉瘤患者的總體生存率較差相關(guān)。通過ALKBH5上調(diào)降低人骨肉瘤細(xì)胞中m6A mRNA水平導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞凋亡和周期阻滯。我們發(fā)現(xiàn)STAT3的負(fù)調(diào)控因子SOCS3是ALKBH5介導(dǎo)的m6A修飾的下游靶點(diǎn)。而m6A修飾的SOCS3 mRNA被YTHDF2識別，促進(jìn)SOCS3的衰變。從機(jī)制上講，ALKBH5通過m6A-YTHDF2依賴性方式增加SOCS3表達(dá)，從而使STAT3途徑失活。本文于2022年發(fā)表在 “eBioMedicine”（IF=11.205）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）ALKBH5在骨肉瘤中的表達(dá)及其與患者生存的關(guān)系

我們的數(shù)據(jù)驗(yàn)證了ALKBH5與人類OS（骨肉瘤）總生存率之間的負(fù)相關(guān)。根據(jù)ALKBH5 mRNA相對表達(dá)的中位數(shù)，OS組分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。所有患者術(shù)前均未接受抗腫瘤治療。如圖1a所示，與低ALKBH5組相比，高ALKBH5腫瘤組織的m6A總甲基化水平較低。通過免疫組織化學(xué)染色進(jìn)一步評估ALKBH5的表達(dá)水平。圖1b顯示了ALKBH5染色的代表性高表達(dá)或低表達(dá)圖像。我們研究了ALKBH5表達(dá)與骨肉瘤患者預(yù)后之間的相關(guān)性。Kaplan-Meier生存分析表明，低ALKBH5表達(dá)患者的總生存時(shí)間明顯短于高ALKBH5表達(dá)患者（圖1c）。此外，對取自正常骨和骨肉瘤組織的15個(gè)樣本進(jìn)行了western bolt分析。在兩種組織中均檢測到ALKBH5的表達(dá)，但與正常骨相比，骨肉瘤中的表達(dá)顯著降低（圖1d）。

2）ALKBH5介導(dǎo)的m6A甲基化減少抑制骨肉瘤細(xì)胞生長并促進(jìn)細(xì)胞凋亡

為了探索ALKBH5介導(dǎo)的U2OS和KHOS細(xì)胞系中m6A甲基化的影響，我們使用慢病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)ALKBH5，并且通過western blot證實(shí)ALKBH5過表達(dá)（圖2a）。ALKBH5上調(diào)細(xì)胞表現(xiàn)出m6A mRNA甲基化減少（圖2b）。在功能上，ALKBH5的過表達(dá)抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。通過CKK-8測定觀察到細(xì)胞活力降低（圖2c）。流式細(xì)胞術(shù)在這兩種細(xì)胞系中觀察到大量凋亡（圖2d）。進(jìn)行TUNEL染色以確認(rèn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（圖2e）。我們的細(xì)胞周期分析表明，骨肉瘤細(xì)胞大多在G0/G1期停滯，這意味著在過表達(dá)ALKBH5后分裂的腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少（圖2f）。為了更好地了解ALKBH5在骨肉瘤中的作用，我們還對KHOS細(xì)胞系進(jìn)行了敲除實(shí)驗(yàn)。使用SiRNA下調(diào)ALKBH5，并通過western blot證實(shí)ALKBH5下調(diào)（圖2g）。進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)（圖2h）和TUNEL（圖2i）分析，確認(rèn)由ALKBH5下調(diào)引起的細(xì)胞凋亡減少。細(xì)胞周期分析（圖2j）表明，在敲除ALKBH5后，分裂的腫瘤細(xì)胞數(shù)量增加。

3）RNA測序鑒定骨肉瘤甲基化改變的轉(zhuǎn)錄本

我們對ALKBH5過表達(dá)的KHOS細(xì)胞進(jìn)行了RNA測序，結(jié)果表明，相對于conrtols，轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)發(fā)生了改變（圖3a）?；蚣患治霰砻鳎町惐磉_(dá)基因與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡密切相關(guān)。我們還發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤細(xì)胞系中m6A甲基化的降低顯著改變了STAT3信號通路（圖3b，c）。我們接下來通過研究STAT3的磷酸化狀態(tài)來確定骨肉瘤細(xì)胞中m6A甲基化的減少是否影響STAT3信號。與對照細(xì)胞系相比，ALKBH5過表達(dá)細(xì)胞系顯示STAT3的磷酸化水平降低（圖3d）。為了弄清楚STAT3磷酸化的這些變化是否刺激STAT3信號傳導(dǎo)，我們評估了STAT3下游靶點(diǎn)的表達(dá)水平。與對照組相比，CyclinD1、c-Myc和bcl-2在細(xì)胞中的活性降低。這些結(jié)果表明，減少m6A甲基化可使STAT3途徑失活。

4）m6A甲基化調(diào)節(jié)STAT3激活調(diào)節(jié)因子的表達(dá)

在ALKBH5過表達(dá)后，STAT3 m6A修飾沒有明顯影響（圖4a），這表明STAT3可能不是骨肉瘤中ALKBH5的直接靶點(diǎn)。為了確定STAT3調(diào)控m6A甲基化的潛在機(jī)制，我們檢測了STAT3的負(fù)調(diào)節(jié)因子SOCS3。我們在U2OS和KHOS細(xì)胞中過表達(dá)ALKBH5。在ALKBH5過表達(dá)后，SOCS3 m6A修飾減少（圖4b）。通過分析已發(fā)布的m6A序列數(shù)據(jù)集（GSE37005），我們發(fā)現(xiàn)SOCS3 mRNA 3’ UTR具有高度富集和特異的m6A峰，并在RMBase v2.0中識別出SOCS3-3’UTR的四個(gè)m6A位點(diǎn)。我們在SOCS3中的四個(gè)假定m6A位點(diǎn)（A到T）進(jìn)行突變，表示為SOCS3MUT：SOCS3-MUT1、SOCS3-MUT2、SOCS3-MUT3、SOCS3-MUT4（僅包含一個(gè)潛在m6A位點(diǎn)）和SOCS3-MUT_1-4（包含所有四個(gè)潛在m6A位點(diǎn)）（圖4c）。然后，我們使用MeRIP-qPCR檢測了SOCS3-WT和SOCS3 MUT中的m6A修飾水平。與ALKBH5的對照載體相比，ALKBH5減少了骨肉瘤細(xì)胞中SOCS3-WT、SOCS3-MUT1、SOCS3-MUT2、SOCS3-MUT3和SOCS3-MUT4的m6A修飾。然而，由于m6A位點(diǎn)突變的存在，與SOCS3-WT相比，SOCS3 MUT（僅包含一個(gè)潛在m6A位點(diǎn)）中m6A修飾的減少程度受到抑制。在ALKBH5過表達(dá)的U2OS和KHOS細(xì)胞中，SOCS3-MUT_1-4的m6A修飾（包含所有四個(gè)潛在的m6A位點(diǎn)突變）沒有減少（圖4d）。基于RT-qPCR，當(dāng)ALKBH5在U2OS和KHOS細(xì)胞中過表達(dá)時(shí)，SOCS3表達(dá)升高（圖4e）。此外，我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用3-脫氮腺苷（DAA）處理時(shí)，骨肉瘤細(xì)胞的SOCS3 m6A修飾水平降低（圖4f）。同時(shí)，SOCS3表達(dá)顯著增強(qiáng)（圖4g）。但在SOCS3-MUT_1-4中未檢測到DAA引起的m6A修飾減少（圖4h）。我們還檢測到骨肉瘤組織中m6A甲基化和SOCS3表達(dá)之間存在線性相關(guān)性（圖4i）。DAA是一種非選擇性藥物，可以全局改變轉(zhuǎn)錄物的甲基化。該甲基化抑制劑用于驗(yàn)證ALKBH5介導(dǎo)的m6A對SOCS3 mRNA穩(wěn)定性的影響。

5）ALKBH5的過表達(dá)通過m6A-YTHDF2依賴機(jī)制增強(qiáng)SOCS3 mRNA的穩(wěn)定性

我們推測SOCS3轉(zhuǎn)錄物是YTHDF2的靶點(diǎn)。為了檢測YTHDF2是否直接結(jié)合SOCS3 mRNA的m6A修飾位點(diǎn)，進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。如圖5a所示，敲低YTHDF2增加了攜帶SOCS3野生型3’ UTR片段的報(bào)告者的熒光素酶活性，而當(dāng)m6A位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，這些變化被消除。在骨肉瘤的生物信息學(xué)分析中，觀察到Y(jié)THDF2和SOCS3之間呈負(fù)相關(guān)（圖5b）。與上述假設(shè)一致，在骨肉瘤細(xì)胞中抑制YTHDF2可提高SOCS3的表達(dá)，其程度與ALKBH5的過表達(dá)相似（圖5c）。通過western blot證實(shí)了YTHDF2敲除效率（圖5c）。我們還敲除了三個(gè)YTHDF同源序列（YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3），以確定三個(gè)YTHDF蛋白是否共同作用以增強(qiáng)m6A修飾的SOCS3的降解。有趣的是，三次敲除后，SOCS3表達(dá)顯著增加。然而，與單獨(dú)下調(diào)YTHDF2相比，當(dāng)這三者同時(shí)下調(diào)時(shí)，可以看到少量增加。在本研究中，與單獨(dú)敲除YTHDF2相比，三重敲除并沒有顯示出顯著更大的效果。接下來，我們進(jìn)行RNA下拉分析以證明YTHDF2結(jié)合骨肉瘤細(xì)胞中的SOCS3全長轉(zhuǎn)錄物（圖5d）。此外，我們檢測了ALKBH5過表達(dá)或YTHDF2抑制的骨肉瘤細(xì)胞和對照細(xì)胞中的RNA衰減率。骨肉瘤細(xì)胞中ALKBH5過表達(dá)和YTHDF2抑制后，SOCS3 mRNA半衰期顯著增加（圖5e）。為了證實(shí)YTHDF2參與ALKBH5對SOCS3的調(diào)節(jié)，我們在YTHDF2缺失的細(xì)胞中調(diào)節(jié)了ALKBH5的表達(dá)，并檢測了SOCS3 RNA的衰減率（圖5f）。我們進(jìn)一步探討了ALKBH5、YTHDF2和SOCS3之間的臨床相關(guān)性。結(jié)果表明，SOCS3表達(dá)與ALKBH5呈正相關(guān)。然而，在人骨肉瘤組織中，YTHDF2表達(dá)與SOCS3呈負(fù)相關(guān)（圖5g，h）。我們的研究表明，ALKBH5的過表達(dá)通過m6A-YTHDF2依賴機(jī)制增強(qiáng)SOCS3 mRNA的穩(wěn)定性。

6）STAT3信號的抑制介導(dǎo)m6A甲基化降低對骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響

為了確定STAT3失活是否是骨肉瘤細(xì)胞m6A甲基化降低后觀察到的增殖抑制、凋亡增加和周期停滯的基礎(chǔ)，我們試圖通過敲除SOCS3來挽救這些表型。SOCS3的下調(diào)增加了ALKBH5過表達(dá)細(xì)胞中p-STAT3的表達(dá)（圖6a，b）。在功能上，SOCS3敲除挽救了由ALKBH5上調(diào)引起的增殖抑制（圖6c）、凋亡升高（圖6d，e）和周期阻滯促進(jìn)（圖6f）。

7）過表達(dá)ALKBH5抑制人體骨肉瘤生長

為了進(jìn)一步研究ALKBH5在人骨肉瘤中的功能，我們在裸鼠皮下移植實(shí)驗(yàn)中檢測ALKBH5是否對骨肉瘤的致瘤性產(chǎn)生關(guān)鍵影響。與對照組相比，當(dāng)植入穩(wěn)定表達(dá)ALKBH5的U2OS細(xì)胞時(shí)，腫瘤的生長被有效抑制（圖7a，b）。通過IHC染色對腫瘤樣本進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在ALKBH5過表達(dá)組中，SOCS3的染色增加，STAT3的表達(dá)減少（圖7c）。此外，在YTHDF2下調(diào)組中，腫瘤生長被有效抑制。然而，ALKBH5對YTHDF2缺乏組的腫瘤生長沒有顯著影響（圖7d）?？偟膩碚f，ALKBH5在人骨肉瘤中通過m6A-YTHDF2依賴性方式發(fā)揮腫瘤抑制作用。

結(jié)論：我們的研究結(jié)果闡明了ALKBH5介導(dǎo)的m6A修飾在人類骨肉瘤中的臨床意義以及腫瘤增殖和生長的調(diào)節(jié)機(jī)制，表明ALKBH5是治療人類骨肉瘤的潛在生物標(biāo)記物。

參考文獻(xiàn)：Yang Z, Cai Z, Yang C, Luo Z, Bao X. ALKBH5 regulates STAT3 activity to affect the proliferation and tumorigenicity of osteosarcoma via an m6A-YTHDF2-dependent manner. EBioMedicine. 2022 Jun;80:104019. doi: 10.1016/j.ebiom.2022.104019. Epub 2022 Apr 28. PMID: 35490460; PMCID: PMC9062761.