ALKBH5通過m6A-YTHDF2依賴性方式影響骨肉瘤的發(fā)展

m6A是最常見和最豐富的mRNA修飾，在許多生物過程中起著至關重要的作用。然而，作為一種關鍵的RNA去甲基酶，ALKBH5在人類骨肉瘤中的研究尚不充分。本研究旨在探討ALKBH5介導的m6A修飾及其在骨肉瘤中的潛在機制。我們的數據表明，ALKBH5的低表達與骨肉瘤患者的總體生存率較差相關。通過ALKBH5上調降低人骨肉瘤細胞中m6A mRNA水平導致細胞增殖抑制、細胞凋亡和周期阻滯。我們發(fā)現STAT3的負調控因子SOCS3是ALKBH5介導的m6A修飾的下游靶點。而m6A修飾的SOCS3 mRNA被YTHDF2識別，促進SOCS3的衰變。從機制上講，ALKBH5通過m6A-YTHDF2依賴性方式增加SOCS3表達，從而使STAT3途徑失活。本文于2022年發(fā)表在 “eBioMedicine”（IF=11.205）上。

技術路線

結果

1）ALKBH5在骨肉瘤中的表達及其與患者生存的關系

我們的數據驗證了ALKBH5與人類OS（骨肉瘤）總生存率之間的負相關。根據ALKBH5 mRNA相對表達的中位數，OS組分為高表達組和低表達組。所有患者術前均未接受抗腫瘤治療。如圖1a所示，與低ALKBH5組相比，高ALKBH5腫瘤組織的m6A總甲基化水平較低。通過免疫組織化學染色進一步評估ALKBH5的表達水平。圖1b顯示了ALKBH5染色的代表性高表達或低表達圖像。我們研究了ALKBH5表達與骨肉瘤患者預后之間的相關性。Kaplan-Meier生存分析表明，低ALKBH5表達患者的總生存時間明顯短于高ALKBH5表達患者（圖1c）。此外，對取自正常骨和骨肉瘤組織的15個樣本進行了western bolt分析。在兩種組織中均檢測到ALKBH5的表達，但與正常骨相比，骨肉瘤中的表達顯著降低（圖1d）。

2）ALKBH5介導的m6A甲基化減少抑制骨肉瘤細胞生長并促進細胞凋亡

為了探索ALKBH5介導的U2OS和KHOS細胞系中m6A甲基化的影響，我們使用慢病毒轉染上調ALKBH5，并且通過western blot證實ALKBH5過表達（圖2a）。ALKBH5上調細胞表現出m6A mRNA甲基化減少（圖2b）。在功能上，ALKBH5的過表達抑制細胞增殖，誘導細胞周期阻滯并促進細胞凋亡。通過CKK-8測定觀察到細胞活力降低（圖2c）。流式細胞術在這兩種細胞系中觀察到大量凋亡（圖2d）。進行TUNEL染色以確認誘導細胞凋亡（圖2e）。我們的細胞周期分析表明，骨肉瘤細胞大多在G0/G1期停滯，這意味著在過表達ALKBH5后分裂的腫瘤細胞數量減少（圖2f）。為了更好地了解ALKBH5在骨肉瘤中的作用，我們還對KHOS細胞系進行了敲除實驗。使用SiRNA下調ALKBH5，并通過western blot證實ALKBH5下調（圖2g）。進行流式細胞術（圖2h）和TUNEL（圖2i）分析，確認由ALKBH5下調引起的細胞凋亡減少。細胞周期分析（圖2j）表明，在敲除ALKBH5后，分裂的腫瘤細胞數量增加。

3）RNA測序鑒定骨肉瘤甲基化改變的轉錄本

我們對ALKBH5過表達的KHOS細胞進行了RNA測序，結果表明，相對于conrtols，轉錄物的表達發(fā)生了改變（圖3a）。基因集富集分析表明，差異表達基因與細胞增殖、細胞周期和凋亡密切相關。我們還發(fā)現，骨肉瘤細胞系中m6A甲基化的降低顯著改變了STAT3信號通路（圖3b，c）。我們接下來通過研究STAT3的磷酸化狀態(tài)來確定骨肉瘤細胞中m6A甲基化的減少是否影響STAT3信號。與對照細胞系相比，ALKBH5過表達細胞系顯示STAT3的磷酸化水平降低（圖3d）。為了弄清楚STAT3磷酸化的這些變化是否刺激STAT3信號傳導，我們評估了STAT3下游靶點的表達水平。與對照組相比，CyclinD1、c-Myc和bcl-2在細胞中的活性降低。這些結果表明，減少m6A甲基化可使STAT3途徑失活。

4）m6A甲基化調節(jié)STAT3激活調節(jié)因子的表達

在ALKBH5過表達后，STAT3 m6A修飾沒有明顯影響（圖4a），這表明STAT3可能不是骨肉瘤中ALKBH5的直接靶點。為了確定STAT3調控m6A甲基化的潛在機制，我們檢測了STAT3的負調節(jié)因子SOCS3。我們在U2OS和KHOS細胞中過表達ALKBH5。在ALKBH5過表達后，SOCS3 m6A修飾減少（圖4b）。通過分析已發(fā)布的m6A序列數據集（GSE37005），我們發(fā)現SOCS3 mRNA 3’ UTR具有高度富集和特異的m6A峰，并在RMBase v2.0中識別出SOCS3-3’UTR的四個m6A位點。我們在SOCS3中的四個假定m6A位點（A到T）進行突變，表示為SOCS3MUT：SOCS3-MUT1、SOCS3-MUT2、SOCS3-MUT3、SOCS3-MUT4（僅包含一個潛在m6A位點）和SOCS3-MUT_1-4（包含所有四個潛在m6A位點）（圖4c）。然后，我們使用MeRIP-qPCR檢測了SOCS3-WT和SOCS3 MUT中的m6A修飾水平。與ALKBH5的對照載體相比，ALKBH5減少了骨肉瘤細胞中SOCS3-WT、SOCS3-MUT1、SOCS3-MUT2、SOCS3-MUT3和SOCS3-MUT4的m6A修飾。然而，由于m6A位點突變的存在，與SOCS3-WT相比，SOCS3 MUT（僅包含一個潛在m6A位點）中m6A修飾的減少程度受到抑制。在ALKBH5過表達的U2OS和KHOS細胞中，SOCS3-MUT_1-4的m6A修飾（包含所有四個潛在的m6A位點突變）沒有減少（圖4d）?；?/span>RT-qPCR，當ALKBH5在U2OS和KHOS細胞中過表達時，SOCS3表達升高（圖4e）。此外，我們發(fā)現，當用3-脫氮腺苷（DAA）處理時，骨肉瘤細胞的SOCS3 m6A修飾水平降低（圖4f）。同時，SOCS3表達顯著增強（圖4g）。但在SOCS3-MUT_1-4中未檢測到DAA引起的m6A修飾減少（圖4h）。我們還檢測到骨肉瘤組織中m6A甲基化和SOCS3表達之間存在線性相關性（圖4i）。DAA是一種非選擇性藥物，可以全局改變轉錄物的甲基化。該甲基化抑制劑用于驗證ALKBH5介導的m6A對SOCS3 mRNA穩(wěn)定性的影響。

5）ALKBH5的過表達通過m6A-YTHDF2依賴機制增強SOCS3 mRNA的穩(wěn)定性

我們推測SOCS3轉錄物是YTHDF2的靶點。為了檢測YTHDF2是否直接結合SOCS3 mRNA的m6A修飾位點，進行了雙熒光素酶報告實驗。如圖5a所示，敲低YTHDF2增加了攜帶SOCS3野生型3’ UTR片段的報告者的熒光素酶活性，而當m6A位點發(fā)生突變時，這些變化被消除。在骨肉瘤的生物信息學分析中，觀察到YTHDF2和SOCS3之間呈負相關（圖5b）。與上述假設一致，在骨肉瘤細胞中抑制YTHDF2可提高SOCS3的表達，其程度與ALKBH5的過表達相似（圖5c）。通過western blot證實了YTHDF2敲除效率（圖5c）。我們還敲除了三個YTHDF同源序列（YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3），以確定三個YTHDF蛋白是否共同作用以增強m6A修飾的SOCS3的降解。有趣的是，三次敲除后，SOCS3表達顯著增加。然而，與單獨下調YTHDF2相比，當這三者同時下調時，可以看到少量增加。在本研究中，與單獨敲除YTHDF2相比，三重敲除并沒有顯示出顯著更大的效果。接下來，我們進行RNA下拉分析以證明YTHDF2結合骨肉瘤細胞中的SOCS3全長轉錄物（圖5d）。此外，我們檢測了ALKBH5過表達或YTHDF2抑制的骨肉瘤細胞和對照細胞中的RNA衰減率。骨肉瘤細胞中ALKBH5過表達和YTHDF2抑制后，SOCS3 mRNA半衰期顯著增加（圖5e）。為了證實YTHDF2參與ALKBH5對SOCS3的調節(jié)，我們在YTHDF2缺失的細胞中調節(jié)了ALKBH5的表達，并檢測了SOCS3 RNA的衰減率（圖5f）。我們進一步探討了ALKBH5、YTHDF2和SOCS3之間的臨床相關性。結果表明，SOCS3表達與ALKBH5呈正相關。然而，在人骨肉瘤組織中，YTHDF2表達與SOCS3呈負相關（圖5g，h）。我們的研究表明，ALKBH5的過表達通過m6A-YTHDF2依賴機制增強SOCS3 mRNA的穩(wěn)定性。

6）STAT3信號的抑制介導m6A甲基化降低對骨肉瘤細胞增殖和凋亡的影響

為了確定STAT3失活是否是骨肉瘤細胞m6A甲基化降低后觀察到的增殖抑制、凋亡增加和周期停滯的基礎，我們試圖通過敲除SOCS3來挽救這些表型。SOCS3的下調增加了ALKBH5過表達細胞中p-STAT3的表達（圖6a，b）。在功能上，SOCS3敲除挽救了由ALKBH5上調引起的增殖抑制（圖6c）、凋亡升高（圖6d，e）和周期阻滯促進（圖6f）。

7）過表達ALKBH5抑制人體骨肉瘤生長

為了進一步研究ALKBH5在人骨肉瘤中的功能，我們在裸鼠皮下移植實驗中檢測ALKBH5是否對骨肉瘤的致瘤性產生關鍵影響。與對照組相比，當植入穩(wěn)定表達ALKBH5的U2OS細胞時，腫瘤的生長被有效抑制（圖7a，b）。通過IHC染色對腫瘤樣本進行分析，結果表明，在ALKBH5過表達組中，SOCS3的染色增加，STAT3的表達減少（圖7c）。此外，在YTHDF2下調組中，腫瘤生長被有效抑制。然而，ALKBH5對YTHDF2缺乏組的腫瘤生長沒有顯著影響（圖7d）?？偟膩碚f，ALKBH5在人骨肉瘤中通過m6A-YTHDF2依賴性方式發(fā)揮腫瘤抑制作用。

結論：我們的研究結果闡明了ALKBH5介導的m6A修飾在人類骨肉瘤中的臨床意義以及腫瘤增殖和生長的調節(jié)機制，表明ALKBH5是治療人類骨肉瘤的潛在生物標記物。

參考文獻：Yang Z, Cai Z, Yang C, Luo Z, Bao X. ALKBH5 regulates STAT3 activity to affect the proliferation and tumorigenicity of osteosarcoma via an m6A-YTHDF2-dependent manner. EBioMedicine. 2022 Jun;80:104019. doi: 10.1016/j.ebiom.2022.104019. Epub 2022 Apr 28. PMID: 35490460; PMCID: PMC9062761.