國(guó)自然新方向——組蛋白乳酸化修飾與腫瘤

組蛋白的翻譯后修飾通過(guò)調(diào)節(jié) DNA 依賴(lài)性過(guò)程（包括轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和 DNA 修復(fù)）在維持體內(nèi)平衡中發(fā)揮重要作用，這些修飾通過(guò)改變核小體之間的接觸或通過(guò)招募非組蛋白來(lái)發(fā)揮作用。組蛋白修飾與生物學(xué)過(guò)程有著密切的關(guān)系，組蛋白修飾的功能意義一直是研究熱點(diǎn)。組蛋白修飾的失調(diào)可以改變轉(zhuǎn)錄激活和抑制的平衡，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生和進(jìn)展。因此，組蛋白修飾是與疾病發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的多功能標(biāo)記。

組蛋白可以通過(guò)多種方式進(jìn)行修飾，包括乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化和 SUMO 化，這些方式早已為人所知。隨著高靈敏度質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，新發(fā)現(xiàn)了各種來(lái)源于細(xì)胞代謝物的組蛋白酰化標(biāo)記，如丙酰化、丁酰化、琥珀?；捅；Ｈ樗峄揎?/span> (lactylation) 為芝加哥大學(xué)趙英明教授團(tuán)隊(duì)于2019年在Nature雜志首次報(bào)道的一種組蛋白翻譯后修飾，發(fā)揮著基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能。組蛋白乳酸化在腫瘤發(fā)生中的作用仍不清楚。由于 Warburg 效應(yīng)（有氧糖酵解）是癌癥的標(biāo)志之一，即使在有氧條件下，癌細(xì)胞也傾向于將葡萄糖轉(zhuǎn)化成乳酸來(lái)產(chǎn)生能量，與正常細(xì)胞相比，葡萄糖代謝的乳酸更多。因此，腫瘤中的組蛋白乳酸化很可能是異常的，探索組蛋白修飾在疾病發(fā)病機(jī)制尤其是腫瘤發(fā)生中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。

有研究表明，組蛋白乳酸化水平在眼部黑色素瘤中上調(diào)，組蛋白乳酸化的抑制有效地抑制了腫瘤進(jìn)展。該文章發(fā)表在Genome Biology期刊上，IF=17.906.

組蛋白乳酸化水平升高與眼部黑色素瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)

為了證明眼部黑色素瘤中蛋白質(zhì)乳酸化水平異常，免疫熒光檢查了眼部黑色素瘤中的蛋白質(zhì)乳酸化水平及其可能的臨床意義。眼部黑色素瘤組織的整體乳酸化水平顯著高于正常黑色素細(xì)胞組織。更高的整體乳酸化水平預(yù)示著癌癥的早期復(fù)發(fā)和增強(qiáng)的侵襲性。WB顯示，在大多數(shù)眼部黑色素瘤細(xì)胞系中，整體乳酸化水平也升高。有趣的是，通過(guò)免疫熒光染色，乳酸化蛋白主要位于細(xì)胞核中，并且蛋白質(zhì)印跡分析中的主要條帶接近 17 kDa。然后我們?cè)趯?duì)乳酸化蛋白進(jìn)行免疫沉淀后進(jìn)行銀染質(zhì)譜（MS），結(jié)果顯示該條帶是組蛋白H3。因此，決定調(diào)查上述現(xiàn)象是否是由 H3K18la 引起的。類(lèi)似地，與正常黑色素細(xì)胞組織相比，眼部黑色素瘤組織中的 H3K18la 水平顯示出與整體乳酸化水平相同的趨勢(shì)，H3K18la 水平升高表明預(yù)后較差。因此，在大多數(shù)眼部黑色素瘤細(xì)胞系中也觀察到了較高的 H3K18la 水平。通過(guò)WB分析證實(shí)了眼部黑色素瘤組織中升高的整體乳酸化和 H3K18la 水平。這些數(shù)據(jù)表明，大部分眼部黑色素瘤的特征是組蛋白乳酸化升高，這可能與眼部黑色素瘤的腫瘤發(fā)生有關(guān)。

抑制組蛋白乳酸化抑制眼部黑色素瘤的腫瘤發(fā)生

為了評(píng)估組蛋白乳酸化抑制是否減弱了眼部黑色素瘤的腫瘤發(fā)生，使用糖酵解抑制2-DG和草酸鹽以及乳酸脫氫酶 (LDHA 和 LDHB) 的 siRNA降低了腫瘤細(xì)胞中的整體細(xì)胞內(nèi)組蛋白乳酸化水平。在眼部黑色素瘤細(xì)胞（OCM1 和 CRMM1細(xì)胞）中，兩種糖酵解抑制劑均實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)乳酸的顯著劑量依賴(lài)性降低，以及整體乳酸化和 H3K18la 水平。接下來(lái)，組蛋白乳酸化降低可有效抑制眼部黑色素瘤細(xì)胞增殖。此外，菌落測(cè)定表明，組蛋白乳酸化水平較低的眼部黑色素瘤細(xì)胞形成的菌落越來(lái)越少。transwell 和傷口愈合試驗(yàn)表明，這些細(xì)胞的遷移能力較弱。在體內(nèi)，我們使用糖酵解抑制劑預(yù)處理的 OCM 細(xì)胞在裸鼠中建立了原位異種移植物。正如預(yù)期的那樣，減少組蛋白乳酸化組的腫瘤重量顯著低于對(duì)照組。由于2-DG和草酸鹽可能具有與抑制乳酸產(chǎn)生和乳酸化無(wú)關(guān)的其他作用，我們進(jìn)一步沉默 LDHA 和 LDHB 以抑制組蛋白乳酸化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)要么缺乏 LDHA或 LDHB眼部黑色素瘤細(xì)胞沒(méi)有表現(xiàn)出整體組蛋白乳酸化的顯著降低。然而，同時(shí)沉默 LDHA 和 LDHB顯著損害組蛋白的乳酸化，同時(shí)引發(fā)細(xì)胞增殖的顯著抑制和遷移。此外，向 LDHA/LDHB 缺陷細(xì)胞中添加回乳酸鈉 (Nala) 成功地增加了組蛋白的乳酸化水平和部分恢復(fù)的細(xì)胞增殖和遷移。

接下來(lái)，乳酸鈉、葡萄糖和魚(yú)藤酮用于提高眼部黑色素瘤細(xì)胞（OCM1 和 CRMM1 細(xì)胞）中的組蛋白乳酸化。然而，我們沒(méi)有觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)的顯著變化或集落形成能力?？傊M蛋白乳酸化的上調(diào)不能進(jìn)一步促進(jìn)眼部黑色素瘤細(xì)胞的腫瘤進(jìn)展。這可能是由于眼部黑色素瘤中組蛋白乳酸化水平升高達(dá)到飽和，這足以導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。盡管眼部黑色素瘤的腫瘤進(jìn)展需要升高的組蛋白乳酸化，但在腫瘤發(fā)生過(guò)程中需要多因素合作。

鑒定組蛋白乳酸化的潛在下游靶基因

為了揭示組蛋白乳酸化在基因表達(dá)中的調(diào)節(jié)作用，首先進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀，然后使用抗 H3K18la 抗體進(jìn)行測(cè)序（ChIP-seq）。ChIP-seq 數(shù)據(jù)顯示 H3K18la 在啟動(dòng)子區(qū)域富集。KEGG分析顯示，這些H3K18la特異性基因富含代謝途徑和腫瘤相關(guān)途徑，表明組蛋白乳酸化在腫瘤發(fā)生中的調(diào)節(jié)作用。草酸鹽處理后下調(diào)基因的 KEGG 分析也富含代謝相關(guān)途徑。接下來(lái)，通過(guò)將ChIP-seq數(shù)據(jù)與是否使用糖酵解抑制劑處理的細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組以及正常和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組的RNA 測(cè)序（RNA-seq）數(shù)據(jù)相結(jié)合，我們鑒定了4個(gè)抗H3K18la-ChIP靶基因，它們?cè)谟锰墙徒庖种苿┨幚淼募?xì)胞中mRNA水平顯著降低，并且在腫瘤細(xì)胞中也高度表達(dá)。在這些候選基因中，YTHDF2 是m6A閱讀器之一，據(jù)報(bào)道在幾種腫瘤中充當(dāng)癌基因；因此，決定專(zhuān)注于它。為了證實(shí) YTHDF2 的轉(zhuǎn)錄被 H3K18la 激活，我們首先在YTHDF2啟動(dòng)子處觀察到 H3K18la 信號(hào)的顯著富集。ChIP-qPCR 分析還表明，H3K18la 在YTHDF2啟動(dòng)子區(qū)域中富集，并且這種富集被糖酵解抑制劑降低。此外，ChIP-qPCR 分析表明，EP300是一種組蛋白乳酸化寫(xiě)入器，在用糖酵解抑制劑處理后，YTHDF2 啟動(dòng)子的結(jié)合水平顯著降低。然而，EP300 的整體蛋白表達(dá)在 YTHDF2 缺陷細(xì)胞中保持不變。值得注意的是，在這種情況下，YTHDF2 啟動(dòng)子的 H3K27ac 水平略有下降。正如預(yù)期的那樣，mRNA和蛋白質(zhì)用糖酵解抑制劑治療后 YTHDF2 表達(dá)水平顯著降低。此外，mRNA 穩(wěn)定性分析表明糖酵解抑制劑不影響 YTHDF2 的 mRNA 穩(wěn)定性。此外，與 EP300 缺陷或糖酵解抑制組相比，我們注意到 YTHDF2 表達(dá)在同時(shí)沉默 EP300 和糖酵解抑制后保持不變。總的來(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明 YTHDF2 的轉(zhuǎn)錄受到 H3K18la 的正向調(diào)節(jié)。

YTHDF2 是眼部黑色素瘤中的一種新癌基因

由于 YTHDF2 可以直接受 H3K18la 調(diào)節(jié)，我們接下來(lái)探討了它在眼部黑色素瘤中的功能。首先，我們發(fā)現(xiàn) YTHDF2 在眼部黑色素瘤細(xì)胞系中的兩個(gè) RNA 都高度表達(dá)和蛋白質(zhì)水平。此外，免疫熒光染色顯示，與正常黑色素細(xì)胞組織相比，眼部黑色素瘤組織中 YTHDF2 的表達(dá)顯著上調(diào)，并且 YTHDF2 的較高表達(dá)與預(yù)后不良呈正相關(guān)。基因表達(dá)譜交互分析（GEPIA）數(shù)據(jù)庫(kù)證實(shí)，高 YTHDF2 水平與較差的預(yù)后相關(guān)。然后，我們通過(guò)用三種shRNA沉默其表達(dá)來(lái)驗(yàn)證 YTHDF2 在眼部黑色素瘤細(xì)胞中的功能。YTHDF2被成功敲低后，我們進(jìn)行了CCK-8測(cè)定，結(jié)果表明與對(duì)照細(xì)胞相比，細(xì)胞生長(zhǎng)顯著降低。此外，我們觀察到 YTHDF2 敲低抑制了腫瘤細(xì)胞集落的形成和遷移，分別通過(guò)平板集落形成測(cè)定和 transwell 測(cè)定來(lái)測(cè)量?？傊@些數(shù)據(jù)表明 YTHDF2 在眼部黑色素瘤中充當(dāng)癌基因。

組蛋白乳酸化通過(guò)m6A閱讀器YTHDF2促進(jìn)癌癥

在確定YTHDF2的表達(dá)受H3K18la調(diào)節(jié)后，我們想確定是否可以通過(guò)獲得 YTHDF2來(lái)挽救組蛋白乳酸化誘導(dǎo)的腫瘤抑制。在眼部黑色素瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá) YTHDF2 后，糖酵解抑制劑的抗癌作用受到部分損害，包括細(xì)胞生長(zhǎng)，菌落形成和遷移。此外，眼部黑色素瘤細(xì)胞中 YTHDF2 的過(guò)表達(dá)加速了腫瘤發(fā)生，這進(jìn)一步表明 YTHDF2 功能的致癌增益?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明 H3K18la 部分通過(guò) YTHDF2 促進(jìn)腫瘤發(fā)生。

PER1 和 TP53 可能是與 YTHDF2 相關(guān)的關(guān)鍵候選基因

為了了解 YTHDF2 在腫瘤發(fā)生中的作用機(jī)制，我們探索了數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)與 YTHDF2 相關(guān)的基因在腫瘤相關(guān)生物學(xué)中富集。 DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期等過(guò)程。進(jìn)一步的 KEGG 分析表明，正相關(guān)基因在RNA降解途徑等途徑中富集，而負(fù)相關(guān)基因在代謝途徑中富集。接下來(lái)，通過(guò)將MeRIP-seq數(shù)據(jù)與用糖酵解抑制劑處理的細(xì)胞的 RNA-seq 數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)在3'UTR中具有m6A峰的13個(gè)基因在用糖酵解抑制劑處理的細(xì)胞中顯著增加，并且與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的YTHDF2呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步的實(shí)時(shí) PCR (RT-PCR) 分析表明，在兩種腫瘤細(xì)胞系中，用糖酵解抑制劑處理后 ，其中2個(gè)基因（PER1 和 TP53）顯著上調(diào)。具體而言，腫瘤抑制基因 PER1和 TP53在 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中與 TYHDF2 呈負(fù)相關(guān)，而 NRAS 和 BRAF 等癌基因與 TYHDF2 呈正相關(guān)。因此，我們假設(shè) YTHDF2 通過(guò)與各自的 m 6 A 位點(diǎn)結(jié)合來(lái)促進(jìn) PER1 和 TP53 的降解。

MeRIP-seq和meCLIP-seq 數(shù)據(jù)顯示 PER1 和 TP53在3' UTR區(qū)域具有 m6A位點(diǎn)。然后應(yīng)用MeRIP-qPCR來(lái)證明 PER1和TP53 的m6A修飾。與IgG 組相比，通過(guò)與m6A特異性抗體的反應(yīng)獲得了 PER1 和TP53 mRNA的富集。正如預(yù)期的那樣，RIP-qPCR分析顯示 PER1和TP53 mRNAs 主要與YTHDF2 相互作用。YTHDF2 敲低顯著上調(diào) PER1和TP53 mRNA和蛋白質(zhì)水平。此外，我們觀察到 PER1 和 TP53 被組蛋白乳酸化誘導(dǎo)劑 (Nala) 下調(diào)并被組蛋白乳酸化抑制劑（2-DG 和草酸鹽）上調(diào)。然后我們研究了 YTHDF2 缺陷細(xì)胞中 PER1和TP53 mRNA 穩(wěn)定性的改變。結(jié)果，YTHDF2 沉默顯著增加了 PER1 和 TP53 的 mRNA 穩(wěn)定性。此外，通過(guò)探索 GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)，我們觀察到 PER1 的更高表達(dá)水平預(yù)示著更好的預(yù)后。與對(duì)照樣本相比，我們還觀察到眼部黑色素瘤組織樣本中的 PER1 和 TP53 水平顯著降低。接下來(lái)，我們檢查了是否可以通過(guò)沉默 PER1 和 TP53 來(lái)?yè)p害 YTHDF2 敲低效應(yīng)。結(jié)果，沉默 PER1 和 TP53 部分恢復(fù)了細(xì)胞增殖。在 YTHDF2 缺陷的眼部黑色素瘤細(xì)胞中?？傊@些數(shù)據(jù)表明異常的 YTHDF2-PER1/TP53 軸有助于眼部黑色素瘤的腫瘤進(jìn)展。

該研究最初揭示了組蛋白乳酸化通過(guò)激活m6A 閱讀蛋白YTHDF2加速腫瘤發(fā)生，從而為治療眼部黑色素瘤提供了新的組蛋白乳酸化靶點(diǎn)。還將組蛋白修飾與RNA修飾聯(lián)系起來(lái)，這為表觀遺傳調(diào)控提供了新的理解。