國自然新方向——組蛋白乳酸化修飾與腫瘤

組蛋白的翻譯后修飾通過調(diào)節(jié) DNA 依賴性過程（包括轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和 DNA 修復(fù)）在維持體內(nèi)平衡中發(fā)揮重要作用，這些修飾通過改變核小體之間的接觸或通過招募非組蛋白來發(fā)揮作用。組蛋白修飾與生物學過程有著密切的關(guān)系，組蛋白修飾的功能意義一直是研究熱點。組蛋白修飾的失調(diào)可以改變轉(zhuǎn)錄激活和抑制的平衡，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生和進展。因此，組蛋白修飾是與疾病發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的多功能標記。

組蛋白可以通過多種方式進行修飾，包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化和 SUMO 化，這些方式早已為人所知。隨著高靈敏度質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，新發(fā)現(xiàn)了各種來源于細胞代謝物的組蛋白?；瘶擞?，如丙?；?、丁?；?、琥珀酰化和丙二?；Ｈ樗峄揎?/span> (lactylation) 為芝加哥大學趙英明教授團隊于2019年在Nature雜志首次報道的一種組蛋白翻譯后修飾，發(fā)揮著基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能。組蛋白乳酸化在腫瘤發(fā)生中的作用仍不清楚。由于 Warburg 效應(yīng)（有氧糖酵解）是癌癥的標志之一，即使在有氧條件下，癌細胞也傾向于將葡萄糖轉(zhuǎn)化成乳酸來產(chǎn)生能量，與正常細胞相比，葡萄糖代謝的乳酸更多。因此，腫瘤中的組蛋白乳酸化很可能是異常的，探索組蛋白修飾在疾病發(fā)病機制尤其是腫瘤發(fā)生中的作用越來越受到關(guān)注。

有研究表明，組蛋白乳酸化水平在眼部黑色素瘤中上調(diào)，組蛋白乳酸化的抑制有效地抑制了腫瘤進展。該文章發(fā)表在Genome Biology期刊上，IF=17.906.

組蛋白乳酸化水平升高與眼部黑色素瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)

為了證明眼部黑色素瘤中蛋白質(zhì)乳酸化水平異常，免疫熒光檢查了眼部黑色素瘤中的蛋白質(zhì)乳酸化水平及其可能的臨床意義。眼部黑色素瘤組織的整體乳酸化水平顯著高于正常黑色素細胞組織。更高的整體乳酸化水平預(yù)示著癌癥的早期復(fù)發(fā)和增強的侵襲性。WB顯示，在大多數(shù)眼部黑色素瘤細胞系中，整體乳酸化水平也升高。有趣的是，通過免疫熒光染色，乳酸化蛋白主要位于細胞核中，并且蛋白質(zhì)印跡分析中的主要條帶接近 17 kDa。然后我們在對乳酸化蛋白進行免疫沉淀后進行銀染質(zhì)譜（MS），結(jié)果顯示該條帶是組蛋白H3。因此，決定調(diào)查上述現(xiàn)象是否是由 H3K18la 引起的。類似地，與正常黑色素細胞組織相比，眼部黑色素瘤組織中的 H3K18la 水平顯示出與整體乳酸化水平相同的趨勢，H3K18la 水平升高表明預(yù)后較差。因此，在大多數(shù)眼部黑色素瘤細胞系中也觀察到了較高的 H3K18la 水平。通過WB分析證實了眼部黑色素瘤組織中升高的整體乳酸化和 H3K18la 水平。這些數(shù)據(jù)表明，大部分眼部黑色素瘤的特征是組蛋白乳酸化升高，這可能與眼部黑色素瘤的腫瘤發(fā)生有關(guān)。

抑制組蛋白乳酸化抑制眼部黑色素瘤的腫瘤發(fā)生

為了評估組蛋白乳酸化抑制是否減弱了眼部黑色素瘤的腫瘤發(fā)生，使用糖酵解抑制2-DG和草酸鹽以及乳酸脫氫酶 (LDHA 和 LDHB) 的 siRNA降低了腫瘤細胞中的整體細胞內(nèi)組蛋白乳酸化水平。在眼部黑色素瘤細胞（OCM1 和 CRMM1細胞）中，兩種糖酵解抑制劑均實現(xiàn)了細胞內(nèi)乳酸的顯著劑量依賴性降低，以及整體乳酸化和 H3K18la 水平。接下來，組蛋白乳酸化降低可有效抑制眼部黑色素瘤細胞增殖。此外，菌落測定表明，組蛋白乳酸化水平較低的眼部黑色素瘤細胞形成的菌落越來越少。transwell 和傷口愈合試驗表明，這些細胞的遷移能力較弱。在體內(nèi)，我們使用糖酵解抑制劑預(yù)處理的 OCM 細胞在裸鼠中建立了原位異種移植物。正如預(yù)期的那樣，減少組蛋白乳酸化組的腫瘤重量顯著低于對照組。由于2-DG和草酸鹽可能具有與抑制乳酸產(chǎn)生和乳酸化無關(guān)的其他作用，我們進一步沉默 LDHA 和 LDHB 以抑制組蛋白乳酸化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)要么缺乏 LDHA或 LDHB眼部黑色素瘤細胞沒有表現(xiàn)出整體組蛋白乳酸化的顯著降低。然而，同時沉默 LDHA 和 LDHB顯著損害組蛋白的乳酸化，同時引發(fā)細胞增殖的顯著抑制和遷移。此外，向 LDHA/LDHB 缺陷細胞中添加回乳酸鈉 (Nala) 成功地增加了組蛋白的乳酸化水平和部分恢復(fù)的細胞增殖和遷移。

接下來，乳酸鈉、葡萄糖和魚藤酮用于提高眼部黑色素瘤細胞（OCM1 和 CRMM1 細胞）中的組蛋白乳酸化。然而，我們沒有觀察到細胞生長的顯著變化或集落形成能力?？傊M蛋白乳酸化的上調(diào)不能進一步促進眼部黑色素瘤細胞的腫瘤進展。這可能是由于眼部黑色素瘤中組蛋白乳酸化水平升高達到飽和，這足以導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。盡管眼部黑色素瘤的腫瘤進展需要升高的組蛋白乳酸化，但在腫瘤發(fā)生過程中需要多因素合作。

鑒定組蛋白乳酸化的潛在下游靶基因

為了揭示組蛋白乳酸化在基因表達中的調(diào)節(jié)作用，首先進行染色質(zhì)免疫沉淀，然后使用抗 H3K18la 抗體進行測序（ChIP-seq）。ChIP-seq 數(shù)據(jù)顯示 H3K18la 在啟動子區(qū)域富集。KEGG分析顯示，這些H3K18la特異性基因富含代謝途徑和腫瘤相關(guān)途徑，表明組蛋白乳酸化在腫瘤發(fā)生中的調(diào)節(jié)作用。草酸鹽處理后下調(diào)基因的 KEGG 分析也富含代謝相關(guān)途徑。接下來，通過將ChIP-seq數(shù)據(jù)與是否使用糖酵解抑制劑處理的細胞的轉(zhuǎn)錄組以及正常和腫瘤細胞的轉(zhuǎn)錄組的RNA 測序（RNA-seq）數(shù)據(jù)相結(jié)合，我們鑒定了4個抗H3K18la-ChIP靶基因，它們在用糖酵解抑制劑處理的細胞中mRNA水平顯著降低，并且在腫瘤細胞中也高度表達。在這些候選基因中，YTHDF2 是m6A閱讀器之一，據(jù)報道在幾種腫瘤中充當癌基因；因此，決定專注于它。為了證實 YTHDF2 的轉(zhuǎn)錄被 H3K18la 激活，我們首先在YTHDF2啟動子處觀察到 H3K18la 信號的顯著富集。ChIP-qPCR 分析還表明，H3K18la 在YTHDF2啟動子區(qū)域中富集，并且這種富集被糖酵解抑制劑降低。此外，ChIP-qPCR 分析表明，EP300是一種組蛋白乳酸化寫入器，在用糖酵解抑制劑處理后，YTHDF2 啟動子的結(jié)合水平顯著降低。然而，EP300 的整體蛋白表達在 YTHDF2 缺陷細胞中保持不變。值得注意的是，在這種情況下，YTHDF2 啟動子的 H3K27ac 水平略有下降。正如預(yù)期的那樣，mRNA和蛋白質(zhì)用糖酵解抑制劑治療后 YTHDF2 表達水平顯著降低。此外，mRNA 穩(wěn)定性分析表明糖酵解抑制劑不影響 YTHDF2 的 mRNA 穩(wěn)定性。此外，與 EP300 缺陷或糖酵解抑制組相比，我們注意到 YTHDF2 表達在同時沉默 EP300 和糖酵解抑制后保持不變?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明 YTHDF2 的轉(zhuǎn)錄受到 H3K18la 的正向調(diào)節(jié)。

YTHDF2 是眼部黑色素瘤中的一種新癌基因

由于 YTHDF2 可以直接受 H3K18la 調(diào)節(jié)，我們接下來探討了它在眼部黑色素瘤中的功能。首先，我們發(fā)現(xiàn) YTHDF2 在眼部黑色素瘤細胞系中的兩個 RNA 都高度表達和蛋白質(zhì)水平。此外，免疫熒光染色顯示，與正常黑色素細胞組織相比，眼部黑色素瘤組織中 YTHDF2 的表達顯著上調(diào)，并且 YTHDF2 的較高表達與預(yù)后不良呈正相關(guān)。基因表達譜交互分析（GEPIA）數(shù)據(jù)庫證實，高 YTHDF2 水平與較差的預(yù)后相關(guān)。然后，我們通過用三種shRNA沉默其表達來驗證 YTHDF2 在眼部黑色素瘤細胞中的功能。YTHDF2被成功敲低后，我們進行了CCK-8測定，結(jié)果表明與對照細胞相比，細胞生長顯著降低。此外，我們觀察到 YTHDF2 敲低抑制了腫瘤細胞集落的形成和遷移，分別通過平板集落形成測定和 transwell 測定來測量?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明 YTHDF2 在眼部黑色素瘤中充當癌基因。

組蛋白乳酸化通過m6A閱讀器YTHDF2促進癌癥

在確定YTHDF2的表達受H3K18la調(diào)節(jié)后，我們想確定是否可以通過獲得 YTHDF2來挽救組蛋白乳酸化誘導(dǎo)的腫瘤抑制。在眼部黑色素瘤細胞中過表達 YTHDF2 后，糖酵解抑制劑的抗癌作用受到部分損害，包括細胞生長，菌落形成和遷移。此外，眼部黑色素瘤細胞中 YTHDF2 的過表達加速了腫瘤發(fā)生，這進一步表明 YTHDF2 功能的致癌增益?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明 H3K18la 部分通過 YTHDF2 促進腫瘤發(fā)生。

PER1 和 TP53 可能是與 YTHDF2 相關(guān)的關(guān)鍵候選基因

為了了解 YTHDF2 在腫瘤發(fā)生中的作用機制，我們探索了數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)與 YTHDF2 相關(guān)的基因在腫瘤相關(guān)生物學中富集。 DNA修復(fù)、細胞凋亡和細胞周期等過程。進一步的 KEGG 分析表明，正相關(guān)基因在RNA降解途徑等途徑中富集，而負相關(guān)基因在代謝途徑中富集。接下來，通過將MeRIP-seq數(shù)據(jù)與用糖酵解抑制劑處理的細胞的 RNA-seq 數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)在3'UTR中具有m6A峰的13個基因在用糖酵解抑制劑處理的細胞中顯著增加，并且與TCGA數(shù)據(jù)庫中的YTHDF2呈負相關(guān)。進一步的實時 PCR (RT-PCR) 分析表明，在兩種腫瘤細胞系中，用糖酵解抑制劑處理后 ，其中2個基因（PER1 和 TP53）顯著上調(diào)。具體而言，腫瘤抑制基因 PER1和 TP53在 TCGA 數(shù)據(jù)庫中與 TYHDF2 呈負相關(guān)，而 NRAS 和 BRAF 等癌基因與 TYHDF2 呈正相關(guān)。因此，我們假設(shè) YTHDF2 通過與各自的 m 6 A 位點結(jié)合來促進 PER1 和 TP53 的降解。

MeRIP-seq和meCLIP-seq 數(shù)據(jù)顯示 PER1 和 TP53在3' UTR區(qū)域具有 m6A位點。然后應(yīng)用MeRIP-qPCR來證明 PER1和TP53 的m6A修飾。與IgG 組相比，通過與m6A特異性抗體的反應(yīng)獲得了 PER1 和TP53 mRNA的富集。正如預(yù)期的那樣，RIP-qPCR分析顯示 PER1和TP53 mRNAs 主要與YTHDF2 相互作用。YTHDF2 敲低顯著上調(diào) PER1和TP53 mRNA和蛋白質(zhì)水平。此外，我們觀察到 PER1 和 TP53 被組蛋白乳酸化誘導(dǎo)劑 (Nala) 下調(diào)并被組蛋白乳酸化抑制劑（2-DG 和草酸鹽）上調(diào)。然后我們研究了 YTHDF2 缺陷細胞中 PER1和TP53 mRNA 穩(wěn)定性的改變。結(jié)果，YTHDF2 沉默顯著增加了 PER1 和 TP53 的 mRNA 穩(wěn)定性。此外，通過探索 GEPIA 數(shù)據(jù)庫，我們觀察到 PER1 的更高表達水平預(yù)示著更好的預(yù)后。與對照樣本相比，我們還觀察到眼部黑色素瘤組織樣本中的 PER1 和 TP53 水平顯著降低。接下來，我們檢查了是否可以通過沉默 PER1 和 TP53 來損害 YTHDF2 敲低效應(yīng)。結(jié)果，沉默 PER1 和 TP53 部分恢復(fù)了細胞增殖。在 YTHDF2 缺陷的眼部黑色素瘤細胞中?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明異常的 YTHDF2-PER1/TP53 軸有助于眼部黑色素瘤的腫瘤進展。

該研究最初揭示了組蛋白乳酸化通過激活m6A 閱讀蛋白YTHDF2加速腫瘤發(fā)生，從而為治療眼部黑色素瘤提供了新的組蛋白乳酸化靶點。還將組蛋白修飾與RNA修飾聯(lián)系起來，這為表觀遺傳調(diào)控提供了新的理解。