單細(xì)胞RNA測(cè)序揭示人類高級(jí)別漿液性卵巢癌的組織結(jié)構(gòu)
高級(jí)別漿液性卵巢癌（HGSOC）的異質(zhì)性沒有得到很好的研究，這嚴(yán)重阻礙了HGSOC的臨床治療。因此，有必要描述HGSOC在其腫瘤微環(huán)境（TME）中的異質(zhì)性。我們通過(guò)深度單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)對(duì)早期或晚期HGSOC患者和非惡性卵巢樣本進(jìn)行分析。我們利用scRNA-seq對(duì)從HGSOC和非惡性卵巢組織中獲得的59324個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)序。在這些細(xì)胞中，腫瘤細(xì)胞具有上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因特征，其中NOTCH1、SNAI2、TGFBR1和WNT11的組合被進(jìn)一步選擇為預(yù)測(cè)HGSOC患者不良預(yù)后的基因?；|(zhì)癌相關(guān)的成纖維細(xì)胞（mCAF）是HGSOC腫瘤中的優(yōu)勢(shì)CAF，在共培養(yǎng)系統(tǒng)中可以誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的EMT特性。特異性免疫細(xì)胞亞群，如C7-APOBEC3A M1巨噬細(xì)胞、CD8+TRM、TEX細(xì)胞，在早期腫瘤中優(yōu)先富集。此外，免疫共抑制受體TIGIT 阻斷可顯著減少小鼠卵巢癌模型中的腫瘤生長(zhǎng)。我們的研究結(jié)果主要應(yīng)用于預(yù)測(cè)HGSOC患者預(yù)后的四種EMT基因模型、mCAFs增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞侵襲的能力以及抗TIGIT治療的潛在治療價(jià)值。本文于2022年6月發(fā)表在“Clinical Cancer Research”（IF=13.801）上。
技術(shù)路線
結(jié)果：
1）非惡性卵巢和原發(fā)性HGSOC腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的單細(xì)胞分析
為了系統(tǒng)地研究HGSOC的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，我們對(duì)12例初治患者的單個(gè)卵巢細(xì)胞進(jìn)行了深度scRNA-seq檢測(cè)，其中包括7例HGSOC患者和5例年齡匹配的非惡性卵巢患者。按照標(biāo)準(zhǔn)程序，從這些樣本中總共獲得59324個(gè)細(xì)胞。其中，33264個(gè)細(xì)胞（56%）來(lái)自HGSOC腫瘤，26060個(gè)（44%）來(lái)自非惡性卵巢（圖1A）。然后對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行聚類，并根據(jù)建立的基因標(biāo)記列表進(jìn)行注釋。使用UMAP方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行可視化，如圖1B所示。此外，圖1C顯示了生態(tài)系統(tǒng)細(xì)胞類型的識(shí)別，包括T細(xì)胞譜系、上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞類型、細(xì)胞周期細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、B細(xì)胞和漿細(xì)胞類型以及平滑肌細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞。然后應(yīng)用KEGG分析來(lái)揭示每個(gè)細(xì)胞子集的特征（圖1D）。對(duì)于HGSOC腫瘤的上皮細(xì)胞，分析顯示與鐵死亡相關(guān)的基因富集。對(duì)于那些在非惡性卵巢組織中，我們的工作顯示了卵巢類固醇生成的基因富集。接下來(lái)，我們將細(xì)胞簇與腫瘤特征相關(guān)聯(lián)。隨著腫瘤分期的延長(zhǎng)，T細(xì)胞簇的比例降低（圖1E）。
2）不同腫瘤階段的生態(tài)系統(tǒng)上皮細(xì)胞特征
我們分析了腫瘤上皮細(xì)胞的特征。在所有組織中共收集14636個(gè)卵巢上皮細(xì)胞，并將其分為12個(gè)簇，包括8192個(gè)來(lái)自HGSOC腫瘤的細(xì)胞和6444個(gè)來(lái)自非惡性卵巢組織的細(xì)胞（圖2A和B）。然后應(yīng)用CytoTRACE預(yù)測(cè)這些上皮細(xì)胞的分化狀態(tài)，并識(shí)別HGSOC中的靜止干細(xì)胞（圖2C）。為了更好地理解上皮細(xì)胞在腫瘤發(fā)展中的作用，將Monocle算法應(yīng)用于惡性上皮細(xì)胞的擬時(shí)分析，以預(yù)測(cè)其發(fā)展軌跡。根據(jù)基因表達(dá)相似性聚集了11個(gè)細(xì)胞簇，并將其投射到一個(gè)擬時(shí)過(guò)程中，該過(guò)程被定義為HGSOC基本期、2期和3期腫瘤（圖2D）。沿著軌跡，第3階段簇1細(xì)胞的基因特征被描述為某些功能途徑，包括focal adhesion、雌激素信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、relaxin信號(hào)通路、凋亡和rap1信號(hào)通路（圖2E）。為了檢查EMT標(biāo)記物與患者生存率的相關(guān)性，使用TCGA和GEO在線分析和可用的OS結(jié)果評(píng)估了TCGA HGSOC數(shù)據(jù)集、GEO HGSOC數(shù)據(jù)集和兩個(gè)漿液性卵巢癌數(shù)據(jù)集。我們的分析表明，四個(gè)基因，包括NOTCH1、SNAI2、WNT11和TGFBR1在這四個(gè)批量表達(dá)數(shù)據(jù)集中的至少三個(gè)隊(duì)列中與不良預(yù)后顯著相關(guān)。值得注意的是，在所有這四個(gè)數(shù)據(jù)集中，這四個(gè)基因的組合與較差的OS相關(guān)（圖2F）。此外，通過(guò)免疫熒光分析進(jìn)一步驗(yàn)證了HGSOC組織中的其他EMT標(biāo)記基因CDH1和VIM，結(jié)果表明，一組強(qiáng)大的細(xì)胞具有潛在的EMT功能（圖2G）。
3）基質(zhì)間充質(zhì)干細(xì)胞的多樣性和CAFs的特征
我們繼續(xù)研究基質(zhì)成纖維細(xì)胞的特征。在13201個(gè)成纖維細(xì)胞中，出現(xiàn)了14個(gè)細(xì)胞簇（圖3A）。在許多非惡性卵巢特異性成纖維細(xì)胞中觀察到間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的特性（圖3A）。根據(jù)每個(gè)基因表達(dá)特征，將非惡性成纖維細(xì)胞分成三個(gè)亞群。MSC亞群1、2和3分別稱為NT5E/THY1/ENG+MSCs、NT5E/ENG+MSC樣細(xì)胞和ENG+MSC樣細(xì)胞（圖3A和B）。在惡性成纖維細(xì)胞中，具有強(qiáng)烈細(xì)胞外基質(zhì)特征的mCAFs，如PTHLH、FGF1、WNT7B、WNT2和TGFB3，是HGSOC腫瘤中的主要CAFs（圖3C）。除此之外，主要來(lái)自癌癥患者6的mCAFs表現(xiàn)出顯著高水平的MMP11、THRC1、POSTN、VCAN和COL10A1（圖3D）。一致地，通過(guò)使用TCGA HGSOC數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析，圖3E一致顯示了這些頂級(jí)標(biāo)記基因的高表達(dá)與患者預(yù)后差之間的相關(guān)性。IF染色表明，晚期HGSOC的mCAFs對(duì)典型CAF標(biāo)記a-SMA、波形蛋白和COL3A以及mCAF標(biāo)記COL10A和MMP11呈陽(yáng)性（圖3F）。這些mCAFs具有一定的促EMT特性，表現(xiàn)為在CAF/卵巢癌細(xì)胞(A2780或OVCAR3) transwell共培養(yǎng)體系中，間充質(zhì)生物標(biāo)記物如ZEB1、波形蛋白和snail在蛋白質(zhì)水平上的上調(diào)，腫瘤細(xì)胞侵襲能力的增加(圖3G和H)。
4）M1巨噬細(xì)胞的富集表明HGSOC早期預(yù)后良好
我們通過(guò)MNN聚類方法將巨噬細(xì)胞簇重新排列為10個(gè)簇，以深入分析細(xì)胞特征（圖4A）。進(jìn)一步將這些簇的基因表達(dá)模式與M1、髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）和M2巨噬細(xì)胞的經(jīng)典表達(dá)模式進(jìn)行比較（圖4B）。我們的結(jié)果表明，C7-APOBEC3A細(xì)胞簇高度表達(dá)M1巨噬細(xì)胞相關(guān)基因，包括IFI6、ISG20、LY6E、IFIT3、CXCL10和IL1RN（圖4B）。簇C0-OLFML3細(xì)胞具有所有三種巨噬細(xì)胞亞型特征，表明HGSOC腫瘤TME中M1、MDSC和M2巨噬細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化（圖4B）。然后在HGSOC組織中檢測(cè)巨噬細(xì)胞與其他免疫細(xì)胞類型的相互作用能力。單核細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的遷移程度在腫瘤晚期減弱，表明巨噬細(xì)胞失去了對(duì)其他免疫細(xì)胞的吸引力（圖4C）。相反，許多代表巨噬細(xì)胞中生長(zhǎng)因子分泌的基因在腫瘤晚期顯著誘導(dǎo)（圖4C）。簇C7-APOBEC3A細(xì)胞已顯示M1巨噬細(xì)胞具有抗腫瘤活性（圖4D）。圖4E顯示C7-APOBEC3A簇顯示趨化因子的分泌增強(qiáng)，包括CCL8、CXCL10、CXCL11和TNFSF10。在C7-APOBEC3A巨噬細(xì)胞中觀察到SAA1、APP、ANXA1和FPR2的誘導(dǎo)，這代表了巨噬細(xì)胞的激活(圖4F)。C7-APOBEC3A簇的基因標(biāo)記與較好的預(yù)后相關(guān)（圖4G），而聚類C1-TCOF1與不良預(yù)后相關(guān)（圖4H）。
5）CD8+T細(xì)胞在HGSOC和非惡性卵巢組織中的分類和功能注釋
與非惡性組織相比，除了巨噬細(xì)胞外，HGSOC腫瘤中淋巴細(xì)胞的特征和分布也得到了表征。HGSOC和非惡性卵巢組織中存在浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞，通過(guò)IHC和IF證實(shí)（圖5A）。由于T細(xì)胞系攜帶CD8A基因富集（圖1C），我們通過(guò)CD8A抗體的IF分析證實(shí)了其在HGSOC腫瘤中的存在（圖5B）。通過(guò)MNN聚類方法將CD8A+T細(xì)胞重組為九個(gè)簇（圖5C），它們分布在不同的組織中（圖5C）。例如，以CD8-C1-IFIT3為代表的組織駐留記憶CD8+T細(xì)胞（CD8+TRM細(xì)胞）更局限于腫瘤組織中。以CD8-C5-DNAJB1基因模式為特征的中央記憶CD8+T細(xì)胞（CD8+TCM細(xì)胞）主要來(lái)自非惡性卵巢細(xì)胞（圖5C）。值得注意的是，耗竭T細(xì)胞（CD8+TEX細(xì)胞），以CD8-C0-CXCL13或CD8-C7TNFRSF4為標(biāo)記，由腫瘤細(xì)胞填充。接下來(lái)，我們關(guān)注了在HGSOC組織中富集的兩種細(xì)胞類型，包括CD8+TRM和CD8+TEX細(xì)胞。為了更好地了解CD8+TEX細(xì)胞在HGSOC中的作用，深入探討了CD8+TEX細(xì)胞的基因表達(dá)模式。在這些標(biāo)記中，CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1、SIRPA和TIGIT是排名靠前的基因（圖5D）。值得注意的是，共抑制受體TIGIT在HGSOC組織中高水平表達(dá)。圖5E顯示，CD8+TEX細(xì)胞的數(shù)量在第一階段早期較高，但在晚期減少。有趣的是，PAGA擬時(shí)分析表明，耗盡T細(xì)胞（CD8+TEX細(xì)胞）的優(yōu)先富集，也稱為CD8+TRM CXCL13細(xì)胞，位于CD8+TRM和TEM細(xì)胞分化的末端（圖5F）。
CD8+TRM細(xì)胞有助于早期HGSOC腫瘤的局部免疫保護(hù)。為了解釋早期HGSOC腫瘤中CD8+TRM細(xì)胞是如何形成的，我們檢查了生存因子的表達(dá)，如IL15、IL17和NOTCH配體，其中，IL15在HGSOC來(lái)源的惡性上皮細(xì)胞中表達(dá)，并誘導(dǎo)CD8+TRM細(xì)胞和CD8+TEX細(xì)胞的形成（圖5G）。除上皮細(xì)胞外，HGSOC腫瘤中的M1巨噬細(xì)胞主要表達(dá)CXCL9和CXCL10，通過(guò)CXCL9/CXCL10-CXCR3相互作用招募CD8+TRM細(xì)胞（圖5G）。我們還檢測(cè)了CD8+TRM細(xì)胞的基因特征與患者生存率的相關(guān)性，并證明CD8+TRM細(xì)胞的特征與改善患者生存率顯著相關(guān)（圖5H）?？偟膩?lái)說(shuō)，我們的發(fā)現(xiàn)有力地表明了早期HGSOC腫瘤中CD8+TRM/TEX細(xì)胞和上皮細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞之間的潛在相互作用機(jī)制。
6）TIGIT阻斷劑在卵巢癌發(fā)生中的作用
已知免疫共抑制受體TIGIT可調(diào)節(jié)抗腫瘤CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，在我們的研究中，其也在CD8+TEX細(xì)胞上高表達(dá)。接下來(lái)，我們測(cè)試了TIGIT阻斷是否有助于卵巢癌的生長(zhǎng)，將ID8細(xì)胞皮下注射到8只雌性C57BL/6小鼠體內(nèi)。8周后，用抗TIGIT或同型匹配的對(duì)照抗體治療ID8荷瘤小鼠（圖6A）。正如預(yù)期的那樣，抗TIGIT治療的小鼠顯示出減少的腫瘤負(fù)擔(dān)（圖6B），如腫瘤生長(zhǎng)遲緩（圖6C）、終點(diǎn)處較低的腫瘤體積和腫瘤重量（圖6D和E）。TIGIT阻斷顯著抑制腫瘤中TIGIT+-CD8+T細(xì)胞的頻率（圖6F和G）。這些結(jié)果表明，抗TIGIT抗體對(duì)CD8+T細(xì)胞的TIGIT中和減輕了ID8荷瘤小鼠的腫瘤負(fù)擔(dān)。
結(jié)論：我們?cè)敿?xì)描述了早期和晚期原發(fā)性HGSOC腫瘤的全面單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜。利用擬時(shí)分析描述不同腫瘤分期的上皮細(xì)胞發(fā)育層次，并鑒定EMT的特性。此外，免疫共抑制受體TIGTI阻斷劑可抑制ID8來(lái)源的C57BL/6小鼠模型的腫瘤生長(zhǎng)。我們的研究報(bào)告了HGSOC獨(dú)特的TME特性以及與腫瘤分期相關(guān)的腫瘤細(xì)胞特征，這將有助于開發(fā)新的治療HGSOC的臨床策略。
參考文獻(xiàn)：
Xu J, Fang Y, Chen K, Li S, Tang S, Ren Y, Cen Y, Fei W, Zhang B, Shen Y, Lu W. Single-cell RNA sequencing reveals the tissue architecture in human high-grade serous ovarian cancer. Clin Cancer Res. 2022 Jun 8:clincanres.0296.2022-1-28 03:44:54.997. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-22-0296.