10分免疫新思路——B細胞分化命運的早期機制
抗體介導的免疫是由B細胞分化為包括漿母細胞、記憶細胞和生發(fā)中心（GC）細胞在內的多個細胞亞群引發(fā)的。B細胞的分化軌跡是由轉錄因子決定的，然而很少有專門決定早期B細胞命運的機制被描述。本研究中，作者報道了一種抑制漿母細胞遺傳程序并促進 GC B細胞命運的轉錄后機制。本研究于2022年5月發(fā)表在《Cell Reports》IF：9.995期刊上。
技術路線：
主要實驗結果：
作者希望研究的是在最初的抗原相遇和GC形成之前的這段時期支持B細胞命運決定的機制和基因程序。為了該目的，對免疫響應后GC形成前的腘窩淋巴結的單細胞懸液進行scRNA-seq檢測。利用UMAP降維分析了6263個細胞，識別了6個簇，并根據它們的基因表達特征對它們進行了注釋（Figures 1A, 1B）。其中一個簇的特征是Igkc和Ighd高表達，Iglc1的低水平表達，并且由于 NP 特異性細胞在B1-8 hi轉基因小鼠中表達Igl，所以這個簇被定義為對抗原沒有反應的原始B細胞（Figures 1B, 1C）。有兩個簇顯示了Fas、Cd86和GC轉錄因子Bcl6的高表達，提示這些細胞處于向GC B細胞分化的過程中（Figures 1B, 1C）。另一個簇表達激活標記Cd86和Fas以及高水平的趨化因子受體Ccr6，這是早期形成記憶細胞(eMBC)的典型特征。一個簇表達Cd86和Fas，但缺乏GC標記，因此被定義為pre-GC細胞。從純化細胞群的RNA-seq數據集中提取的基因特征用于驗證每個集群的細胞分配（Figures 1C）。正如預期的那樣，細胞周期分析表明，原始細胞和eMBC大部分是非周期細胞，而一些pre-GC細胞和大部分早期GC B細胞是積極增殖的（Figures 1D）。利用假時間順序將細胞沿可能的發(fā)育軌跡放置，可以預測pre-GC簇可能產生GC B細胞以及eMBC細胞亞群（Figures 1E）。因此，使用scRNA-seq能夠識別pre-GC和具有形成成熟GC細胞能力的早期GC B細胞。
為了確定可能指導早期B細胞向GC B細胞定型的分子機制，對在pre-GC 簇中高表達的基因進行了GO富集分析，與原始和eMBC簇相比。在符合這些標準的 991個基因中，359 個基因被注釋為編碼RBP的基因（Figures 1F）。為了進一步表征早期進入GC B細胞期間RBP的表達，查詢了所有注釋為編碼RBP 的基因 (GO: 0003723)。該分析證實，pre-GC細胞以及早期GC簇的細胞表現出最高的編碼RBP基因的表達水平（Figures 1G）。這些結果表明RBP在早期B細胞分化和GC形成中發(fā)揮作用。
有趣的是，編碼m6a結合蛋白的Ythdf2是符合富集標準的基因之一（在從原始細胞到pre-GC細胞的過渡期間，表達顯著增加）（Figures 1H）。通過對Ythdf2表達作為偽時間函數的分析發(fā)現，它在發(fā)育軌跡的早期上調，從pre-GC細胞開始，在早期GC亞群中保持上調（Figures 1H, 1I）。Ythdf蛋白家族包含3個同源基因，然而，在整個B細胞系中，Ythdf1和Ythdf3的表達顯著低于Ythdf2（Figure 1I）。與此相一致的是，利用qRT-PCR和多個引物對分選的B1-8 hi B細胞進行分析，證實Ythdf2在免疫反應早期被誘導，并在抗原特異性B細胞中占主導地位（Figure1J）。這些結果表明Ythdf2h是naive B細胞通過pre-GC狀態(tài)向早期分化的GC細胞轉變的潛在調節(jié)劑。
圖1 YTHDF2在生發(fā)中心形成前B 細胞激活后上調表達
2、抗原特異性B細胞定位于淋巴結外濾泡區(qū)表達YTHDF2
接下來，確定YTHDF2蛋白在早期B細胞活化和GC形成過程中在B細胞中的表達模式。流式細胞術分析顯示GL-7+ FAS+ B細胞在免疫應答第3天表達YTHDF2蛋白最多，第5天和第7天逐漸減少（Figure 2A）。在多克隆免疫反應中也觀察到 YTHDF2 對疫苗接種的強烈上調，該免疫反應包括表達具有不同特異性和親和力的免疫球蛋白的 B 細胞（Figure 2B）。因此，YTHDF2在抗原特異性B細胞免疫應答早期上調，并且在GC形成期持續(xù)表達。
為了檢測B細胞在體內表達YTHDF2的部位，將表達YTHDF2-GFP的TdTomato+ B1-8hi B細胞轉入宿主小鼠。在反應的第3天，約50%的TdTomato+ B1-8hi B細胞定位至靠近淋巴結包膜區(qū)域并高表達YTHDF2-GFP，并且其表達頻率在淋巴結皮層深處的區(qū)域下降（Figures 2C, 2D）。運動B細胞的實時成像顯示，YTHDF2存在于細胞的細胞質中，包括前緣和后緣；然而，由于尾緣含有較多的細胞質，大部分的YTHDF2蛋白質都位于這一區(qū)域（Figures 2E）。為了研究免疫球蛋白親和性是否影響YTHDF2的表達，將B細胞轉入表達低親和性NP特異性BCRs (B1-8lo)和YTHDF2-GFP的小鼠，并將GFP表達與B1-8hi B細胞進行比較。結果發(fā)現，在NP-KLH免疫后3天，B1-8hi B細胞表達的YTHDF2水平高于低親和力的細胞（Figure 2F）。綜上所述，這些結果表明YTHDF2在位于淋巴結濾泡外區(qū)的B細胞中表達上調，且BCR親和力調節(jié)其表達。
圖2 YTHDF2蛋白表達在生發(fā)中心形成前上調
3、生發(fā)中心的形成依賴于YTHDF2
為了確定YTHDF2是否在抗體免疫反應中發(fā)揮作用，將Ythd2fl /fl小鼠與B細胞特異性CD23-Cre小鼠株（CD23-DF2fl/+和CD23-DF2fl/fl）雜交。ELISA結果顯示，表達一個或兩個Ythdf2-flox拷貝的小鼠血清IgM和IgG1水平較低，表明該基因是單倍不足的（Figure 3A）。為檢測抗原特異性抗體的產生情況，用NP-KLH免疫小鼠，免疫1周和2周后ELISA檢測血清中NP特異性抗體的存在情況。與野生型相比，CD23-DF2fl/fl小鼠在GC形成的第7天產生低水平的抗體；然而，這種差異在統計上并不顯著（Figure 3B）。反應第14天GC形成后，CD23-DF2fl/fl中檢測到極低水平的抗原特異性抗體，而CD23-DF2fl/+產生了結合總NPs和低密度NPs的IgG1（Figure 3B）?？偟膩碚f，這些實驗表明，一個有效的抗體介導的免疫反應依賴于YTHDF2。
由于GC是抗體形成細胞的主要來源，接下來確定GC的形成是否依賴于YTHDF2。首先通過WT小鼠腹腔注射OVA啟動，然后過繼CD23-DF2fl/fl或WT B1-8hi naive B細胞，然后用NP-OVA增強（Figure 3C）。流式細胞術分析增強7天后腘淋巴結來源的細胞，結果顯示，CD23-DF2fl/fl B1-8hi B細胞經過繼后分化為GC細胞的比例比對照細胞低3.9倍（Figure 3D）。與對照組相比，缺乏Ythdf2的B細胞的PC/GC比率降低不明顯，且PC/GC比率較高（Figure 3D）。流式細胞術分析少數CD23-DF2fl/fl B1-8hi GC B細胞未表達YTHDF2-GFP（Figure 3E）。為了進一步研究YTHDF2在GC形成中的意義，將WT和YTHDF2缺失的B1-8hi B細胞混合轉移到WT宿主體內，然后給它們注射NP-OVA促進劑。7d后的流式細胞儀分析顯示，在競爭條件下，Ythdf2缺陷的B1-8hi B細胞分化為GC細胞的能力完全受阻（Figure 3F）。因此，YTHDF2對產生完整的抗體介導的免疫反應至關重要，主要是通過促進GC的形成。
圖3YTHDF2是有效的抗體介導的免疫反應和生發(fā)中心形成所必需的
4、YTHDF2是生發(fā)中心形成所必需的而不是早期B細胞激活所需
為了評估YTHDF2是否是早期階段B細胞免疫應答所必須的，將WT和YTHDF2缺陷的B1-8hi B細胞一起轉入宿主小鼠，并在NP-KLH免疫后3-7天通過流式細胞術檢測FAS+ GL-7+ B細胞的存在。結果顯示，在GC形成前的免疫反應第5天，YThdf2缺陷B細胞的頻率顯著降低（Figure 4A）。為了研究Ythdf2缺陷如何影響B(tài)細胞定位，使用TPLSM掃描完整的淋巴結。免疫后第5天淋巴結皮層可見CD23-DF2+/+ B1-8hi B細胞，第7天可見清晰的GC結構（Figure 4B）。CD23-DF2fl/fl B1-8hi B細胞轉染小鼠后第5天檢測到細胞簇；但2 d后未形成成熟的GC，提示GC形成需要YTHDF2（Figure 4B）。為了確定YTHDF2是在GC形成過程中發(fā)揮作用，而不是在同源抗原的初始激活過程中發(fā)揮作用，檢測了YTHDF2缺陷的B細胞是否能夠在體內對抗原作出反應。免疫16 h后，Ythdf2缺陷的B細胞檢測到CD86、MHC-II、CD40等典型激活標志物表達上調（Figure 4C）。此外，CellTrace Violet追蹤發(fā)現沒有早期B1-8hi B細胞增殖缺陷（Figure 4D）。此外，在體外，通過增加anti-IgM劑量刺激B細胞，并沒有發(fā)現任何顯著的增殖缺陷或CD86表達的Ythdf2缺陷B細胞（Figure 4E）。 因此，BCR參與觸發(fā)的B細胞活化和增殖不依賴于YTHDF2。
圖4 YTHDF2是早期B細胞免疫響應所必需的而不是初始的B細胞激活所需
5、YTHDF2 抑制GC形成期間漿母細胞遺傳程序
體內實驗之間的差異表明，GC 形成對 YTHDF2 有很大依賴性，而在沒有 YTHDF2 的情況下，早期 B 細胞活化和增殖沒有受到干擾，這表明這種 m6A 閱讀器在 B 細胞分化和命運決定中發(fā)揮作用，而不是在細胞周期進程和克隆擴增中發(fā)揮作用。為了進一步評估YTHDF2對B細胞發(fā)育哪個階段至關重要，研究了支持B細胞命運的遺傳程序。篩選WT和Ythdf2缺陷的B1-8hi B細胞，這些細胞在免疫接種5天后對受體宿主的抗原產生反應，并對它們進行RNA-seq。總計獲得159個差異表達基因，值得注意的是，PB和PC中典型表達的基因，如Irf4、Xbp1、Sdc1和Prdm1，在Ythdf2缺陷的GL-7+ FAS+ B細胞中高表達（Figures 5A and 5B）。這些變化反映在GSEA揭示的ASC基因信號的表達增加（Figures 5C）。因此，YTHDF2在B細胞免疫反應的早期階段抑制PB基因程序。
為了進一步研究在缺乏YTHDF2的情況下早期反應的B細胞的細胞命運，進行了scRNA-seq分析，共有11227個細胞顯示了類似于圖1中描述的集群（Figure 5D）。然而，盡管Ythdf2缺陷的B細胞分化為pre-GC和eMBC亞群，但它們形成的早期GC B細胞明顯較少（Figure 5E）。與轉錄組結果一致，發(fā)現響應的Ythdf2缺陷B細胞形成了相對更多的PC，與對照B細胞比較（Figure 5F）。接下來，研究了早期FAS+ GL-7+ Ythdf2缺陷的B細胞是否除了ASC基因表達增加外，還具有PB相關功能。為了確保亞型特異性轉錄本的檢測，使用分選的多克隆naive B細胞作為陰性對照，PC作為陽性對照。如預期的，如果有sIgM轉錄本的話，naive B細胞表現得非常低，而PC顯示sIgM與mIgM轉錄本的比例非常高（Figure 5G）。這些結果為YTHDF2在pre-GC和GC早期抑制PB遺傳程序中的作用提供了額外的證據。
6、YTHDF2直接與漿母細胞調節(jié)基因的甲基化mRNA相互作用
由于前文的研究結果表明YTHDF2在抑制PB遺傳程序中發(fā)揮作用，作者試圖確定該蛋白是否可以直接靶向PB促進基因。為此，用脂多糖刺激分離的B細胞3天，在體外生成表達PB基因的細胞。然后，使用抗m6a抗體進行RNA免疫沉淀，并使用高通量測序作為讀數。IP與對照組的比較顯示，在Ythdf2缺陷B細胞中上調的幾個PC分化基因，包括Prdm1、Sdc1、Xbp1和Irf4，顯示出一個或多個m6A峰（Figure 6A）。此外，通過分析已發(fā)表的YTHDF2 IP在B細胞發(fā)育過程中的數據集發(fā)現Irf4和Xbp1轉錄本都直接與YTHDF2結合（Figure 6B）。Sdc1也與YTHDF2結合；然而，這個峰值在缺乏mRNA甲基化機制的細胞中持續(xù)存在，表明非特異性結合。從LPS刺激的轉基因B細胞中提取HA-YTHDF2-GFP進行RNA免疫沉淀，然后進行qRT-PCR，得到類似的結果（Figure 6C）。這些發(fā)現表明YTHDF2有可能在轉錄后水平直接調節(jié)PC分化基因。
在早期反應的B細胞中上調的PB相關基因中，Irf4被認為是最上游的B細胞命運調控因子。免疫后5天對CD23-DF2+/+和CD23-DFfl/fl細胞中IRF4蛋白表達的分析表明，與對照相比，CD23-DFfl/fl 細胞中顯示高水平 IRF4 的活化 CD138 陰性 B 細胞的頻率是對照組的 2.5 倍，并且通過平均熒光強度測量檢測到每個細胞的蛋白質水平增加（Figure 6D）。激活的和Ythdf2缺乏的B細胞中也檢測到MYC蛋白水平的小幅升高（Figure 6E）。這些結果表明，YTHDF2具有通過調節(jié)IRF4 mRNA和蛋白表達水平直接調控PC形成的潛力。
圖6漿母細胞調節(jié)基因轉錄物是 YTHDF2 的直接靶標
7、生發(fā)中心和漿母細胞的形成不依賴于YTHDF1或YTHDF3
YTHDF蛋白在結構上非常相似，幾項研究表明，所有三個同源段都促進RNA降解，并可以補償任何同源段的損失。由于本文的結果顯示Ythdf2的一個等位基因不足以產生完整的抗體介導的免疫反應，所以測試了YTHDF1和YTHDF3是否也有助于GC的形成。與Ythdf2缺陷B細胞相反，過繼轉染Ythdf1-和Ythdd3缺陷B1-8hi B細胞可有效生成GC細胞和PC細胞（Figures 7A and 7B）。在競爭條件下檢測到Ythdf1缺陷的PCs和GC細胞頻率較高，而Ythdf3缺陷的B細胞這些細胞亞群的頻率沒有變化（Figures 7C and 7D）。這些結果表明，與YTHDF2相比，Ythdd1/3序列不通過對B細胞中YTHDF總蛋白庫的貢獻來促進GC B細胞的形成。流式細胞儀檢測免疫后第3、5、7天B1-8hi B細胞，顯示FAS+ GL-7+ B1-8hi B細胞的形成不需要YTHDF1和YTHDF3（Figure 7E）。然而，來自免疫小鼠的FAS+ GL-7+ B1-8hi B細胞的RNA-seq實驗顯示，在Ythdf2缺陷B細胞中顯著差異表達的基因在缺少Ythdf1和Ythdf3的情況下也發(fā)生了類似的改變，盡管程度較輕（Figures 7F and 7G）。雖然沒有在Ythdf1和Ythdf3缺陷B細胞的基因表達數據集中檢測到IRF4水平的增加，但在Ythdf3缺陷B細胞中觀察到ASC信號的增加（Figures 7G）。因此，YTHDF2在B細胞中起主導作用，而非YTHDF1和YTHDF3，這是由于它在B細胞中高表達。
圖7生發(fā)中心的形成不依賴于YTHDF1和YTHDF3
總之，本研究使用scRNA-seq 和轉基因小鼠證明YTHDF2由早期反應的抗原特異性B細胞表達，并通過抑制與漿細胞形成相關的基因促進其分化為生發(fā)中心 B細胞，而其他YTHDF旁系同源物對于體液免疫反應是可有可無的。
圖8圖文摘要
參考文獻：
Grenov Amalie., Hezroni Hadas., Lasman Lior., Hanna Jacob H., Shulman Ziv. (2022). YTHDF2 suppresses the plasmablast genetic program and promotes germinal center formation. Cell Rep, 39(5), 110778. doi:10.1016/j.celrep.2022.110778