m6A閱讀器YTHDF3介導(dǎo)的PRDX3翻譯減輕肝纖維化

PRDX3是線粒體氧化應(yīng)激的主要調(diào)節(jié)因子，并發(fā)揮肝臟保護(hù)作用，但PRDX 3在肝纖維化中的作用尚不清楚。本研究旨在闡明PRDX3對(duì)肝纖維化的影響以及m6A修飾調(diào)節(jié)PRDX3的潛在機(jī)制。在動(dòng)物模型和患者臨床標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)PRDX3表達(dá)與肝纖維化呈負(fù)相關(guān)。PRDX3沉默加劇了肝纖維化和肝星狀細(xì)胞（HSC）激活，而HSC特異性過表達(dá)PRDX3減輕了肝纖維化。在機(jī)制上，PRDX3至少部分通過ROS/TGF-β1/Smad2/3途徑抑制HSC激活。此外，PRDX3 mRNA被m6A修飾，并與m6A閱讀器YTHDF1-3互作。更重要的是，當(dāng)YTHDF3（而不是YTHDF1/2）被敲除時(shí)，PRDX3表達(dá)被抑制。PRDX3翻譯以m6A依賴的方式直接受YTHDF3調(diào)節(jié)，從而影響其在肝纖維化中的功能?？偟膩碚f，PRDX3是肝纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在HSC中靶向YTHDF3/PRDX3軸可能是一種很有希望的治療肝纖維化的方法。本文于2022年6月發(fā)表在“Redox Biology”雜志（IF= 10.787）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）PRDX3在人和小鼠的纖維化肝組織中表達(dá)降低

我們最初檢測(cè)了慢性肝纖維化患者肝組織中PRDX3的表達(dá)，以探討PRDX3在臨床肝纖維化中的潛在作用。重度纖維化患者的PRDX3蛋白水平明顯低于輕度纖維化患者。在纖維化肝臟中檢測(cè)到膠原和α-SMA的積聚（圖1A）。這些結(jié)果表明PRDX3下調(diào)參與了人肝纖維化。然后，我們使用纖維化動(dòng)物模型進(jìn)一步確定PRDX3表達(dá)與肝纖維化之間的相關(guān)性。用CCl4處理的小鼠表現(xiàn)出顯著降低的PRDX3蛋白和mRNA水平，這些降低伴隨著纖維化標(biāo)記物Col1a1和α-SMA的表達(dá)增加（圖1B和C）。免疫組化（IHC）染色顯示，CCl4誘導(dǎo)的小鼠PRDX3表達(dá)下降與纖維化肝臟中α-SMA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖1D）。這些數(shù)據(jù)表明，PRDX3的表達(dá)與肝纖維化的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。

2）PRDX3下調(diào)加重肝纖維化

為了進(jìn)一步了解PRDX3在肝纖維化中的作用，通過尾靜脈將PRDX3-shRNA注射到小鼠體內(nèi)。如圖2A-C所示，PRDX3敲除加重了肝損傷，并增加了AST、ALT、TNF-α和IL-1β的水平。與這些發(fā)現(xiàn)一致，在注射PRDX3 shRNA的小鼠中檢測(cè)到顯著的纖維化誘導(dǎo)，表現(xiàn)為更強(qiáng)的Sirius Red and Masson染色，更高的羥脯氨酸含量，以及纖維化和HSC激活相關(guān)基因（Col1a1，α-SMA，CTGF和TIMP1）的表達(dá)水平增加（圖2A，D-F）。此外，PRDX3敲除導(dǎo)致H2O2含量顯著增加，這表明PRDX3沉默在肝纖維化期間誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS積累（圖2G）?；谶@些結(jié)果，PRDX3敲除加重HSC激活和體內(nèi)肝纖維化。

3）HSC特異性過表達(dá)PRDX3減輕肝纖維化

由于HSC激活是肝纖維化的關(guān)鍵因素，我們假設(shè)針對(duì)HSC中PRDX3的治療可能預(yù)防肝纖維化。如圖3A所示，外源性flag標(biāo)記的PRDX3成功轉(zhuǎn)染到HSC中。正如所料，PRDX3在HSC中特異性過表達(dá)顯著減輕了肝損傷和纖維化，如肝臟HE的改善、Masson、Sirius Red和α-SMA-PRDX3染色的改善以及纖維化和HSC激活相關(guān)標(biāo)記物的水平下降（圖3B-F）。此外，在AAV9-pGFAP-PRDX3處理的小鼠中觀察到H2O2含量降低，這表明PRDX3過表達(dá)減少了肝纖維化中的細(xì)胞內(nèi)ROS積累（圖3G）。因此，HSC特異性PRDX3過表達(dá)顯著減輕小鼠肝纖維化。

4）PRDX3通過調(diào)節(jié)線粒體ROS/TGF-β1/Smad2/3途徑抑制HSC激活

我們進(jìn)一步研究了PRDX3介導(dǎo)的線粒體ROS是否參與HSC激活。如圖4A所示，PRDX3主要定位于LX-2細(xì)胞的線粒體中。經(jīng)TGF-β1處理后，線粒體ROS水平、線粒體膜電位和H2O2含量增加，PRDX3過表達(dá)后顯著降低（圖4B-E）。PRDX3沉默導(dǎo)致活性氧生成旺盛，但在mito-TEMPO處理后，ROS生成減弱（圖4F和G）。此外，mito-TEMPO顯著減弱了PRDX3敲除引起的肝纖維化惡化和HSC激活（圖4H和I）。這些結(jié)果表明，PRDX3減少肝纖維化中HSC激活的潛在機(jī)制可能主要通過抑制線粒體ROS的產(chǎn)生來介導(dǎo)。

越來越多的證據(jù)表明，線粒體ROS參與肝纖維化形成的機(jī)制是通過TGF-β1/ Smad2/3通路介導(dǎo)的。然后，我們探索了PRDX3介導(dǎo)的線粒體ROS生成調(diào)控是否與HSC中TGF-β1/Smad2/3通路相關(guān)。結(jié)果表明，HSC特異性過表達(dá)PRDX3可顯著降低p-Smad2和p-Smad3的體內(nèi)外表達(dá)水平。此外，PRDX3敲除增加了HSC活化相關(guān)基因和纖維化基因的水平，而TGF-β1抑制劑SB431542處理顯著降低了這些增加(補(bǔ)充圖，未展示在文章中)。這些數(shù)據(jù)表明，PRDX3通過抑制TGF-β1/Smad2/3通路減輕HSC活化和肝纖維化。

5）m6A修飾調(diào)節(jié)PRDX3的表達(dá)并影響其在肝纖維化中的功能

由于PRDX3是肝纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，我們進(jìn)一步探索了PRDX3上游的潛在機(jī)制。SRAMP預(yù)測(cè)PRDX3 mRNA中存在多個(gè)潛在的m6A位點(diǎn)；因此，我們推測(cè)PRDX3在肝纖維化中的調(diào)節(jié)依賴于m6A修飾。首先，我們檢測(cè)了肝纖維化中m6A的水平。如圖5A所示，在肝纖維化中觀察到總RNA群體中m6A水平升高。隨后，帶有m6A特異性抗體的MeRIP qRT–PCR證明PRDX3 mRNA在LX-2細(xì)胞中顯著富集（圖5B），這表明PRDX3對(duì)肝纖維化的作用可能與其m6A修飾有關(guān)。此外，為了進(jìn)一步研究m6A基序在PRDX3調(diào)節(jié)中的功能，用腺嘌呤-鳥嘌呤（A-G）突變替換了SRAMP預(yù)測(cè)的PRDX3中的三個(gè)m6A位點(diǎn)，如下所示：PRDX3-mut1（A399G）、PRDX3-mut2（A534G）、PRDX3-mut3（A1037G）和PRDX3-mut1-3（A399G、A534G、A1037G）。將這些突變體轉(zhuǎn)染到LX-2細(xì)胞中。PRDX3突變體中的m6A水平明顯低于野生型PRDX3（PRDX3-WT）（圖5C和D）。更重要的是，PRDX3 mut1-3的m6A水平的下降程度大于只有一個(gè)潛在m6A突變的mRNA的下降程度，這表明三個(gè)m6A位點(diǎn)的合作是PRDX3 m6A修飾的關(guān)鍵機(jī)制（圖5C）。此外，m6A基序突變后，PRDX3蛋白水平顯著降低（圖5E-G），這表明PRDX3的m6A修飾可能調(diào)節(jié)肝纖維化中的PRDX3蛋白質(zhì)表達(dá)。然后，我們探討了PRDX3的m6A修飾是否進(jìn)一步調(diào)節(jié)了其對(duì)肝纖維化的保護(hù)作用。與使用PRDX3-WT獲得的結(jié)果相比，PRDX3 m6A位點(diǎn)突變顯著誘導(dǎo)HSC激活和肝纖維化（圖5E-H）?；谶@些數(shù)據(jù)，m6A修飾可能參與PRDX3的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，并改變其在肝纖維化中的表達(dá)和功能。

6）PRDX3 mRNA翻譯由YTHDF3以m6A依賴的方式調(diào)節(jié)

我們?cè)噲D確定通過m6A修飾在肝纖維化中調(diào)節(jié)PRDX3表達(dá)的關(guān)鍵m6A閱讀器。RNA下拉結(jié)合質(zhì)譜法鑒定LX-2細(xì)胞中的PRDX3 mRNA相互作用蛋白（圖6A）。在質(zhì)譜結(jié)果中，YTHDF1-3和IGF2BP2-3特異性結(jié)合PRDX3 mRNA（圖6B）。在肝纖維化過程中，YTHDF1-3表達(dá)明顯下調(diào)，而IGF2BP2-3的表達(dá)沒有顯著差異，表明YTHDF 1-3可能是肝纖維化期間影響PRDX3 mRNA的潛在m6A閱讀器（補(bǔ)充圖，未展示）。此外，敲除YTHDF3而非YTHDF1/2抑制了PRDX3蛋白的表達(dá)（圖6C）。相反，YTHDF3過表達(dá)顯著增加了PRDX3蛋白的表達(dá)（圖6D）。通過使用生物素化的PRDX3 mRNA進(jìn)行YTHDF3下拉，進(jìn)一步確定了YTHDF 3和PRDX3之間的特定相互作用（圖6E）。RIP分析表明，與IgG免疫沉淀物相比，PRDX3 mRNA在含YTHDF3的免疫沉淀物中富集（圖6F）。這些數(shù)據(jù)表明，YTHDF3與PRDX3特異性結(jié)合，并調(diào)節(jié)其在LX-2細(xì)胞中的表達(dá)。        

由于YTHDF3通過其在YTH結(jié)構(gòu)域中的m6A結(jié)合點(diǎn)（W438和W492）與m6A位點(diǎn)結(jié)合，W438與W492突變消除了YTHDF 3的mRNA結(jié)合能力。因此，用表達(dá)YTHDF3-WT或具有W438A和W492A突變的YTHDF3-mut的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞。RIP分析表明，在轉(zhuǎn)染YTHDF3-WT的細(xì)胞中，PRDX3 mRNA有效免疫沉淀，而YTHDF 3-mut和PRDX3 mRNA之間的相互作用顯著減少（圖6G）。此外，YTHDF3-WT而非YTHDF 3-mut增加了PRDX3的表達(dá)。具有m6A位點(diǎn)突變的PRDX3在存在YTHDF3-WT過表達(dá)的情況下沒有表現(xiàn)出顯著的蛋白質(zhì)水平增加（圖6H），這表明YTHDF3介導(dǎo)的PRDX3表達(dá)調(diào)節(jié)依賴于m6A。由于YTHDF3增加了m6A修飾的mRNAs的翻譯效率，我們隨后試圖確定YTHDF 3是否調(diào)節(jié)PRDX3的翻譯。事實(shí)上，YTHDF3敲除抑制了PRDX3的翻譯（圖6I）。這些結(jié)果表明，在肝纖維化中，PRDX3 mRNA的翻譯可能以m6A依賴性的方式受YTHDF3的調(diào)節(jié)。

7）PRDX3敲除抑制HSC特異性過表達(dá)YTHDF3對(duì)小鼠肝纖維化的保護(hù)作用

我們觀察到人類和小鼠纖維化肝臟中的YTHDF3蛋白水平顯著降低，這表明YTHDF3表達(dá)與肝纖維化的進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)（圖7A）。此外，我們進(jìn)一步探討了YTHDF3是否通過調(diào)節(jié)PRDX3表達(dá)在肝纖維化中發(fā)揮作用。我們首先驗(yàn)證了HSC中YTHDF3過表達(dá)的特異性（圖7B和C）。HSC特異性過表達(dá)YTHDF3顯著減輕了肝損傷和纖維化（圖7D-G）。值得注意的是，HSC中的YTHDF3過表達(dá)顯著增加了PRDX3蛋白水平，并減少了細(xì)胞氧化損傷（圖7F，H）。然而，PRDX3敲除可消除AAV9-pGFAP-YTHDF3對(duì)肝纖維化的保護(hù)作用（圖7D-H）。這些數(shù)據(jù)表明HSC特異性過表達(dá)YTHDF3主要通過上調(diào)PRDX3表達(dá)顯著減輕CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化。

結(jié)論：PRDX3的HSC特異性過表達(dá)通過抑制線粒體ROS/TGF-β1/Smad2/3信號(hào)傳導(dǎo)抑制HSC激活并改善肝纖維化。機(jī)制上，YTHDF3特異性調(diào)節(jié)PRDX3的翻譯和表達(dá)，并在肝纖維化過程中影響其功能。我們的結(jié)果表明靶向HSC中的YTHDF3/PRDX3軸可能是一種有希望的治療肝纖維化的策略。

參考文獻(xiàn)：Sun R, Tian X, Li Y, Zhao Y, Wang Z, Hu Y, Zhang L, Wang Y, Gao D, Zheng S, Yao J. The m6A reader YTHDF3-mediated PRDX3 translation alleviates liver fibrosis. Redox Biol. 2022 Aug;54:102378. doi: 10.1016/j.redox.2022.102378.