與癌癥的糾纏——33.883分的m6A對(duì)腫瘤免疫的介導(dǎo)

N⁶ -甲基腺苷（m⁶A）是最常見的RNA修飾被認(rèn)為是結(jié)直腸癌（CRC）重要的上轉(zhuǎn)錄機(jī)制癌癥。結(jié)直腸癌是全球范圍內(nèi)癌癥發(fā)病率和死亡率的主要原因之一。本研究目的是探索腫瘤內(nèi)生性m6A修飾是否以及如何驅(qū)動(dòng)通過甲基轉(zhuǎn)移酶樣3 （METTL3）介導(dǎo)CRC的免疫結(jié)構(gòu)。結(jié)果證實(shí)，在CRC細(xì)胞中METTL3的沉默可以減少M(fèi)DSCs積累，最終抑制ApcMin/+Mettl3+/-小鼠、CD34+人源化小鼠和同基因的小鼠模型中CD4+和CD8+ T細(xì)胞的活化和增殖。這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)，在結(jié)直腸癌中靶向METTL3可提高ICB治療結(jié)直腸癌的療效。本研究于2022年6月發(fā)表在《Gastroenterology》IF: 33.883期刊上。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、  METTL3缺失可抑制結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生，減少MDSCs積累

與野生型同窩小鼠相比，在ApcMin/+小鼠模型7中，METTL3雜合敲除小鼠（METTL3+/ -）的腫瘤明顯減少。結(jié)果表明，METTL3耗盡顯著降低了MDSCs，但增加了CD4+和CD8+ T細(xì)胞（圖1A和1B），推斷在METTL3缺失時(shí)抗腫瘤活性提高。一致地，ApcMin/+Mettl3+/-小鼠結(jié)腸組織中通過免疫組化（IHC）染色與ApcMin/+小鼠比較，發(fā)現(xiàn)CD8+細(xì)胞水平較高（圖S1C）。為了解免疫反應(yīng)的改變，研究對(duì)ApcMin/+和ApcMin/+Mettl3+/-小鼠結(jié)腸組織中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)趨化因子及其相應(yīng)的受體。METTL3耗盡抑制促炎細(xì)胞因子IL6、TNF-α、C4B、CXCL1、NOS2和IL1B mRNA表達(dá)（圖1C）。通過附加的ApcMin/+和qPCR驗(yàn)證了這一點(diǎn)ApcMin/+Mettl3+/-小鼠樣本（圖1D）。研究進(jìn)一步采集外周血單核細(xì)胞（PBMCs）用于細(xì)胞因子23-Plex免疫測(cè)定（圖1E）。值得注意的是， CXCR2配體、MDSCs關(guān)鍵趨化因子CXCL1的血清水平為與ApcMin/+小鼠相比，ApcMin/+Mettl3+/-小鼠顯著降低（P< .05，圖1 F）。因此，METTL3可以調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫。

圖1 METTL3可以調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫。

2、  METTL3敲除可誘導(dǎo)CRC異體移植物抗腫瘤免疫反應(yīng)

為了驗(yàn)證METTL3在抑制CRC抗腫瘤免疫中的潛在作用，作者用CRISPRCas9敲除CT26和MC38兩種小鼠CRC細(xì)胞系中的METTL3 （M3KO） （圖2A）。MC38-M3KO同種異體移植瘤體積和重量顯著高于對(duì)照組與MC38-NC組相比降低（圖2B）。通過分析免疫細(xì)胞在腫瘤、PBMC和脾臟中，研究觀察到抗腫瘤免疫增強(qiáng)在攜帶MC38-M3KO同種異體移植的小鼠中，MDSCs顯著減少，特別是粒細(xì)胞樣MDSC （G-MDSC）伴CD4+和CD8+ T升高細(xì)胞（圖2）。此外，觀察到增加的干擾素γ （IFN-γ）+和腫瘤壞死MC38-M3KO異體移植物中因子α （TNF-α）+ CD8+ T細(xì)胞增加細(xì)胞毒性t細(xì)胞活化（圖2E）。為了證明研究的發(fā)現(xiàn)，接下來建立了原位結(jié)直腸癌模型。小鼠接受右旋糖酐鈉治療在MC38細(xì)胞定植前誘導(dǎo)一過性結(jié)腸損傷。通過活體嚙齒動(dòng)物結(jié)腸鏡檢查，確定MC38同種異體移植物接種成功（圖2 G）。沉默METTL3可顯著降低腫瘤數(shù)量和腫瘤負(fù)荷在小鼠結(jié)腸中（圖2H）。此外，小鼠體內(nèi)存在MC38-M3KO與對(duì)照組小鼠相比，同種異體移植小鼠PBMC中的MDSCs顯著減少（圖2）。研究結(jié)果共同表明METTL3缺失增強(qiáng)抗腫瘤免疫抑制CRC生長(zhǎng)。

圖2  沉默METTL3可恢復(fù)抗腫瘤免疫。

3、表達(dá)METTL3的CRC細(xì)胞通過分泌CXCL1招募MDSC

為了揭示METTL3促進(jìn)CRC免疫抑制的機(jī)制，對(duì)MC38-NC和MC38-M3KO細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq（圖3A）。在MC38敲除METTL3后，1612個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，1428個(gè)基因表達(dá)下調(diào)上調(diào)（圖3A）。值得注意的是，敲除METTL3與下調(diào)白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用途徑可能與癌癥或免疫細(xì)胞相互作用有關(guān)（圖3B）?；蛑屑?xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用途徑，CXCL1、CXCL10顯著降低和CCL2在MC38-M3KO細(xì)胞中表達(dá)（圖3C） qPCR也證實(shí)METTL3敲除抑制CT26和MC38細(xì)胞中CXCL1、CXCL10和CCL2 mRNA的表達(dá)（圖3D）。相反，CT26中METTL3的異位表達(dá)起到相反的作用（圖3E）。在APCmin/+Mettl3+/-組血清CXCL1水平顯著降低與APCmin/+小鼠比較（圖1F）。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明敲除METTL3可顯著減少細(xì)胞培養(yǎng)上清中CXCL1的分泌在CT26和MC38細(xì)胞中（圖3F），以及在含有CT26和MC38細(xì)胞的小鼠血清中MC38同種異體移植（圖3G）。因此，METTL3促進(jìn)CRC中CXCL1的表達(dá)。CXCL1是趨化刺激因子通過與受體CXCR2結(jié)合，將MDSC招募到腫瘤微環(huán)境中。因此，推測(cè)METTL3可以通過CXCL1的分泌促進(jìn)MDSCs的招募。

圖3  METTL3通過CXCL1-CXCR2軸招募MDSCs。

4、METTL3在CRC中促進(jìn)m⁶A-BHLHE41驅(qū)動(dòng)CXCL1轉(zhuǎn)錄

METTL3是m6A甲基化的主要甲基轉(zhuǎn)移酶。闡明METTL3依賴的m6A修飾與CXCL1表達(dá)之間的聯(lián)系，m6A-seq是在MC38-NC和MC38-M3KO細(xì)胞中進(jìn)行（圖4A）。研究檢測(cè)到9477和9092m6A峰值分別出現(xiàn)在MC38-NC和MC38-M3KO中，主要位于編碼區(qū)序列區(qū)（CDS）和三素?cái)?shù)非翻譯區(qū)（3 ' -UTR）密度較大停止密碼子周圍的峰值（圖4B）。m6A以GGAC為標(biāo)識(shí)（圖4 B）。這些潛在的METTL3靶點(diǎn)是在多種信號(hào)通路中富集，尤其是在DNA轉(zhuǎn)錄方面（圖4C）。因此，通過RNA-seq鑒定，因此，通過RNA-seq鑒定，METTL3敲除細(xì)胞中有1612個(gè)下調(diào)轉(zhuǎn)錄本用于Pscan識(shí)別149個(gè)過代表轉(zhuǎn)錄因子（RNA-seq）和289個(gè)METTL3靶點(diǎn)（m6A-seq）縮小到5個(gè)候選（圖4D）， BHLHE41， ETS1， REST， SP4和YY1（圖4 E）。MeRIP-qPCR證實(shí)他們的m6A水平顯著降低在CT26和MC38細(xì)胞中敲除METTL3后（圖4F）。此外，基因敲除METTL3抑制CT26和MC38細(xì)胞BHLHE41蛋白表達(dá)；而ETS1和YY1蛋白水平保持不變（SP4檢測(cè)不到）（圖4G）。因此，BHLHE41是METTL3潛在的下游靶點(diǎn)。CT26細(xì)胞中METTL3的異位表達(dá)增加了BHLHE41蛋白表達(dá)式（圖4 G）。接下來詢問BHLHE41是否與Cxcl1啟動(dòng)子結(jié)合以介導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄。ChIP-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BHLHE41可以直接結(jié)合Cxcl1的啟動(dòng)子區(qū)域（圖4 H）。最終，BHLHE41的敲除廢除了推廣METTL3對(duì)MDSC遷移的影響（圖4J）。這些數(shù)據(jù)共同表明在CRC細(xì)胞中，METTL3促進(jìn)m6A-BHLHE41驅(qū)動(dòng)CXCL1轉(zhuǎn)錄。

圖 4  METTL3可以促進(jìn)CRC中BHLHE41蛋白表達(dá)。

5、METTL3驅(qū)動(dòng)的MDSC積累抑制T細(xì)胞增殖促進(jìn)CRC增長(zhǎng)

接下來，作者研究MDSC對(duì)表達(dá)METTL3的CRC T細(xì)胞的抑制能力微環(huán)境。從CT26同種異體移植物中分離出CD11b+Gr-1+ MDSCs，然后在體外與T細(xì)胞以不同比例共培養(yǎng)（圖5A）。此外，參與MDSC抑制功能的基因表達(dá)，包括ARG1，S100A9和TGFB1在METTL3缺失的MDSCs中顯著降低CT26異體移植（圖5D）?？笹r -1抗體顯著耗盡MDSCs，消除METTL3在CT26同基因模型中的促腫瘤作用（圖5 E）。同樣，CXCR2抑制劑SB265610也能有效地消除METTL3的誘導(dǎo)作用MDSC募集和CRC異體移植在體內(nèi)的生長(zhǎng)（圖5F）。研究得出結(jié)論，METTL3驅(qū)動(dòng)MDSC積累和抑制效能促進(jìn)結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)。

圖 5  METTL3可招募抑制性MDSC促進(jìn)CRC。

6、在人源化免疫系統(tǒng)小鼠模型中METTL3的缺失可以增強(qiáng)抗腫瘤免疫并降低CRC的生長(zhǎng)

為了證實(shí)METTL3在調(diào)節(jié)人抗腫瘤免疫應(yīng)答中的作用，CD34+采用人源化小鼠模型在小鼠體內(nèi)復(fù)制人體免疫系統(tǒng)。免疫缺陷NSG小鼠靜脈注射人CD34+造血干細(xì)胞亞致死γ照射后的干細(xì)胞（圖6A）。流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)在小鼠接種腫瘤之前，人CD45+細(xì)胞包含>25%的PBMCs（圖6 B）。皮下注射METTL3敲除或未敲除的HCT116細(xì)胞植入（圖6C）。研究觀察到METTL3缺失對(duì)HCT116腫瘤有抑制作用在CD34+人源化小鼠中生長(zhǎng)（圖6D），而在CD34+人源化小鼠中效果不明顯非人性化NSG小鼠。接下來，作者比較了免疫的浸潤(rùn)情況METTL3敲除或不敲除HCT116腫瘤組織中的細(xì)胞（圖6E），METTL3的消耗導(dǎo)致MDSC減少，尤其是G-MDSC的顯著降低，隨著CD4+和CD8+ T細(xì)胞的增加（圖6F），證實(shí)了作者的發(fā)現(xiàn)METTL3誘導(dǎo)CRC的抗腫瘤免疫反應(yīng)。此外，在HCT116腫瘤中敲除METTL3顯著抑制BHLHE41（圖6G）和CXCL1（圖6H）蛋白表達(dá)。最后，METTL3蛋白表達(dá)為與原發(fā)性人結(jié)直腸癌組織中CD33+ MDSCs浸潤(rùn)顯著相關(guān)（圖6I）。總之，METTL3的沉默增強(qiáng)了抗腫瘤免疫抑制結(jié)直腸癌生長(zhǎng)。

圖 6  敲除METTL3誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，可以抑制結(jié)直腸癌在人源化小鼠模型中生長(zhǎng)。

7、靶向METTL3增強(qiáng)抗PD -1治療抑制結(jié)直腸癌的效果

鑒于METTL3招募抑制性MDSC來促進(jìn)CRC的免疫抑制，作者下一步研究了在CRC中靶向METTL3是否可以提高ICB的療效治療。為此，使用antiPD-1處理對(duì)照和METTL3敲除MC38異體移植物。研究發(fā)現(xiàn)，METTL3敲除或單獨(dú)抗PD -1治療與對(duì)照相比都能降低腫瘤尺寸和重量（圖7A，7B）。重要的是，他們對(duì)MC異體移植物具有較強(qiáng)的抑制作用腫瘤緩解率60%（6 / 10）（圖7A, 7B）。PBMC浸潤(rùn)MDSCs的豐度，尤其是G-MDSC，以及血清CXCL1顯著增加METTL3敲除+抗PD -1處理MC38異體移植減少（圖7C和7 D）。接下來，作者評(píng)估了對(duì)METTL3的藥理抑制是否可以達(dá)到同樣的效果的效果。STM2457是一種高效、選擇性的METTL3抑制劑。同樣，PBMC浸潤(rùn)MDSC和血清在STM2457加抗PD -1處理后CXCL1明顯減少（圖7G和7 H）。相反，在MC38同種異體移植物中，活化T細(xì)胞浸潤(rùn)率最高（圖7I和7J）。綜上所述，研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)METTL3是CRC的潛在治療靶點(diǎn)，其抑制可恢復(fù)抗腫瘤免疫，增強(qiáng)ICB治療的療效。

圖 7  使用抗PD -1聯(lián)合METTL3抑制CRC。

綜上所述，研究證明了RNA m6A甲基轉(zhuǎn)移酶的作用和機(jī)制，METTL3在CRC中抑制宿主抗腫瘤免疫應(yīng)答。METTL3促進(jìn)m6A-BHLHE41-CXCL1/CXCR2軸招募免疫抑制MDSCs抑制CD8+ T細(xì)胞，從而促進(jìn)CRC。METTL3抑制加上抗PD-1表現(xiàn)了對(duì)CRC具有良好的抗腫瘤作用，強(qiáng)調(diào)METTL3在CRC治療中是一個(gè)潛在的目標(biāo)。

參考文獻(xiàn)：

Chen H, Pan Y, Zhou Q, Liang C, Wong CC, Zhou Y, Huang D, Liu W, Zhai J, Gou H, Su H, Zhang X, Xu H, Wang Y, Kang W, Kei Wu WK, Yu J.（2022）.METTL3 inhibits anti-tumor immunity by targeting m6A-BHLHE41-CXCL1/CXCR2 axis to promote colorectal cancer. Gastroenterology, undefined (undefined), undefined. doi: 10.1053/j.gastro.2022.06.024.