整合單細(xì)胞RNA測(cè)序與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示間質(zhì)性膀胱炎的免疫景觀

間質(zhì)性膀胱炎（IC）是一種以劇烈的盆腔疼痛和泌尿系統(tǒng)癥狀為特征的膀胱疼痛綜合征，是一種嚴(yán)重的慢性疾病。目前，IC的病因和病理生理仍不清楚，診斷困難，治療困難。因此，迫切需要了解IC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，找到有效的治療靶點(diǎn)。最近，有研究通過scRNA-Seq結(jié)合CyTOF對(duì)CD45+單細(xì)胞進(jìn)行了全面的表型和功能研究。然后，通過多模態(tài)交集分析，將scRNA-Seq獲得的免疫觀點(diǎn)與空間轉(zhuǎn)錄組（ST）的結(jié)果整合，揭示了IC患者膀胱的免疫景觀。該研究發(fā)表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》，IF：38.104。

技術(shù)路線：

主要結(jié)果：

1. IC膀胱CD45+免疫細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜

為了破譯和構(gòu)建IC的免疫圖譜，作者使用scRNA-seq來檢測(cè)IC和健康志愿者膀胱的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性（圖1a）。病理特征顯示IC膀胱較對(duì)照組：尿路上皮剝蝕或解剖喪失、血管生成、免疫細(xì)胞浸潤（圖1b）。IC患者和對(duì)照組的膀胱標(biāo)本新鮮采集，解剖，消化成單個(gè)細(xì)胞，共分離出135,091個(gè)CD45+免疫單細(xì)胞并進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制，共獲得了92,029個(gè)優(yōu)質(zhì)CD45+免疫細(xì)胞（圖1c）。細(xì)胞計(jì)數(shù)與基因之間有較高的相關(guān)系數(shù)（R = 0.8995），而與線粒體基因之間沒有相關(guān)系數(shù)（R =?0.006）（圖1d）。檢測(cè)到7種具有最明顯的造血和組織譜系定義基因的細(xì)胞類型，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、髓細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、NK細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞 （圖1e-h）。去除雙聯(lián)細(xì)胞后，當(dāng)前的細(xì)胞景觀由94.42%的CD45+免疫細(xì)胞和5.58%的CD45 -單細(xì)胞組成（圖1h）。

圖1 scRNA-seq和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）工作流程概述

2. T和B細(xì)胞譜系的逐步聚類發(fā)現(xiàn)CD8+ T細(xì)胞功能障礙和B細(xì)胞異?；罨?/span>

為了表征IC組和對(duì)照組之間單個(gè)T細(xì)胞亞群的變化，作者將T細(xì)胞亞群化，并根據(jù)經(jīng)典T細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)獲得9個(gè)亞群：即5個(gè)CD4+ T細(xì)胞簇、3個(gè)CD8+ T細(xì)胞簇和1個(gè)NKT細(xì)胞簇（圖2a）。在CD4+ T細(xì)胞中，通過獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄因子和marker的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)輔助T細(xì)胞簇，包括Tregs和濾泡輔助T細(xì)胞（Tfh）（圖2b），還發(fā)現(xiàn)了IL-10，在treg中幾乎檢測(cè)不到，這可能意味著IC組免疫調(diào)節(jié)紊亂。通過高表達(dá)CCL5、CXCR6和PRDM1識(shí)別效應(yīng)性記憶性CD4+ T細(xì)胞（CD4+ Tem），通過表達(dá)IL-7R、CCR7和SELL識(shí)別中樞記憶性CD4+ T細(xì)胞（CD4+ Tcm）。CD69和ICOS在這些簇中上調(diào)，提示這些細(xì)胞更可能是中樞記憶性CD4+ T細(xì)胞而不是初始T細(xì)胞。TCF7和KLF2的表達(dá)表明早期中樞記憶性T細(xì)胞表型（圖2b）。對(duì)T細(xì)胞亞群比例的分析表明，IC膀胱中treg細(xì)胞顯著增加，Th17細(xì)胞顯著減少（圖2c）。對(duì)IC組與對(duì)照組相比的差異表達(dá)基因（DEGs）進(jìn)行GO和KEGG富集分析。treg的DEGs主要富集在mRNA分解代謝過程、病毒受體和黏著斑（圖2d）。而Th17細(xì)胞的DEGs主要富集在經(jīng)典的炎癥信號(hào)通路，如IL-17信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路（圖2e）。CD8A和細(xì)胞毒基因（GZMA、GZMK、GZMB、NKG7和PRF1）高表達(dá)，鑒定出兩個(gè)CD8+效應(yīng)T細(xì)胞簇（CD8+ Tef）。CD8+ Tef細(xì)胞高表達(dá)細(xì)胞毒標(biāo)志物，GZMK+ CD8+ T細(xì)胞簇中GZMK表達(dá)水平最高，GZMA和GZMB表達(dá)水平較低?；罨腃D8+ T細(xì)胞表達(dá)活化基因（如TRAC、TRBC1和ACTB），但其細(xì)胞毒性活性水平相對(duì)較低（圖2a、b）。CD8+ T細(xì)胞的耗竭marker用NR4A2, ISG20, TANK和CAPZB表示。IC組衰竭基因表達(dá)水平相對(duì)高于對(duì)照組（圖2f, g），提示CD8+ T在該慢性疾病中存在功能障礙。為了進(jìn)一步研究B細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)錄變化，將B細(xì)胞亞群分為6個(gè)B細(xì)胞亞群（圖2h），包括初始B細(xì)胞、過渡性B細(xì)胞（tbc）、活化B細(xì)胞、未轉(zhuǎn)換的記憶B細(xì)胞（USMB）、轉(zhuǎn)換后的記憶B細(xì)胞（SMB）和漿細(xì)胞 （圖2i）?；罨疊細(xì)胞和USMB顯著增加，SMB和TBC減少（圖2J）。IC組B細(xì)胞以活化B細(xì)胞為主（46.32%），提示IC組B細(xì)胞活化程度逐漸加重。衰老相關(guān)基因的表達(dá)水平在IC組和對(duì)照組之間無顯著差異（圖2k）。B細(xì)胞的異常激活和漿細(xì)胞的鑒定提示IC患者可能會(huì)發(fā)生強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)。因此，檢測(cè)患者和對(duì)照者血漿、尿液中的免疫球蛋白IgA、IgM、IgG、IgE。雖然兩組之間血漿中所有免疫球蛋白的含量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但I(xiàn)C患者尿液中發(fā)現(xiàn)IgE顯著增加（圖2l），提示IgE可能是IC的一個(gè)潛在的尿液生物標(biāo)志物。

圖2 T細(xì)胞和B細(xì)胞聚焦分析

3.骨髓細(xì)胞簇的分類和注釋顯示為免疫相關(guān)的巨噬細(xì)胞

作者描述了髓系細(xì)胞的分子和功能差異，共鑒定出6種細(xì)胞類型，包括中性粒細(xì)胞、炎癥性CD14+巨噬細(xì)胞、M2樣巨噬細(xì)胞、傳統(tǒng)樹突狀細(xì)胞（CDC）、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（PDC）和肥大細(xì)胞 （圖3A）。IC膀胱中的大多數(shù)髓系細(xì)胞是中性粒細(xì)胞（51.20%），而不是肥大細(xì)胞（圖3B）。與對(duì)照組相比，IC組中性粒細(xì)胞中DEGS的KEGG分析顯示，在抗原處理和呈遞以及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎通路中顯著富集（圖3C）。擬時(shí)分析描繪了從CD14+巨噬細(xì)胞到M2樣巨噬細(xì)胞的主流發(fā)展軌跡（圖3D, E）。在分化過程中，促炎基因（IL-1Β、S100A8和NLRP3）在CD14+巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，但隨著時(shí)間的推移逐漸下調(diào)。同時(shí)，吞噬基因和調(diào)節(jié)受體（CD163、FOLR2、STAB1、C1QA和MSR1）在M2樣巨噬細(xì)胞中逐漸上調(diào)（圖3F）。與對(duì)照組相比，炎性CD14+巨噬細(xì)胞的功能與炎癥產(chǎn)生有關(guān) （圖3g）。然而，m2樣巨噬細(xì)胞主要通過MHC-II類分子調(diào)節(jié)免疫（圖3h）。此外，m2樣巨噬細(xì)胞的DEGs主要富集于自身免疫性疾病 （圖3i）。為了驗(yàn)證兩種不同巨噬細(xì)胞的存在，對(duì)CD68、S100A8和CD163進(jìn)行了免疫熒光染色（圖3j）。

圖3聚焦分析骨髓細(xì)胞

4. 用CyTOF證實(shí)免疫表型異質(zhì)性

對(duì)IC患者膀胱內(nèi)的免疫亞群進(jìn)行了CyTOF表征，并驗(yàn)證了scRNA-seq結(jié)果（圖4a）。每個(gè)聚類中所選標(biāo)記的蛋白水平如圖4b所示。圖4b, c顯示了IC患者和對(duì)照組的40個(gè)聚類。對(duì)CD45+免疫細(xì)胞進(jìn)行CyTOF分析（圖4d）。根據(jù)經(jīng)典標(biāo)志物，確定了不同的細(xì)胞亞群，包括CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DCs、肥大細(xì)胞和活化細(xì)胞，推測(cè)的細(xì)胞類型與scRNA-seq的結(jié)果一致（圖4e）。這些數(shù)據(jù)有助于驗(yàn)證和構(gòu)建IC膀胱中的細(xì)胞免疫細(xì)胞圖譜。

圖4細(xì)胞質(zhì)量分析（Mass cytometry, CyTOF）證實(shí)IC膀胱免疫細(xì)胞表型異質(zhì)性

5. IC的免疫激活網(wǎng)絡(luò)

為了確定IC組中細(xì)胞激活之間的潛在相互作用，作者分析了相應(yīng)的受體和配體的表達(dá)模式。相互作用對(duì)主要分布在內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CDC和效應(yīng)性記憶性CD4+ T細(xì)胞的表面（圖5a）。基于IC組中top50交互對(duì)的免疫激活網(wǎng)絡(luò)如圖5b所示。兩個(gè)趨化因子受體在幾乎所有細(xì)胞亞群中都有表達(dá)，但它們的配體主要在成纖維細(xì)胞中表達(dá)（圖5c和補(bǔ)充圖4b）。這些結(jié)果提示上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞可能協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞在IC膀胱中的轉(zhuǎn)移。炎癥因子（TNF, IFNG和IL-1β）的高表達(dá)水平表明IC膀胱內(nèi)存在穩(wěn)健的炎癥反應(yīng)（圖5d）。此外，趨化因子CCL5在幾乎所有類型的細(xì)胞中均上調(diào)。ELISA檢測(cè)證實(shí)尿液中CCL5水平高，但血液中無CCL5水平高（圖5e），因此CCL5可能是IC的尿液生物標(biāo)志物。此外，IC膀胱中Treg細(xì)胞中IL-10和IL-35的表達(dá)降低（圖5f），TGF-β信號(hào)通路的表達(dá)上調(diào)（圖5g），提示IC膀胱中Treg細(xì)胞功能障礙。再加上CD8+ T耗竭，這些結(jié)果可能提示IC組存在免疫調(diào)節(jié)功能障礙，這可能導(dǎo)致持續(xù)的炎癥和纖維化。IC患者上皮細(xì)胞的DEGs除了參與免疫應(yīng)答外，還富集于人乳頭瘤病毒感染、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用（圖5h）。在成纖維細(xì)胞的富集分析中獲得了類似的結(jié)果（圖5i）。對(duì)IC膀胱上皮細(xì)胞的前5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了預(yù)測(cè)，包括NR2F1、FOXA1、HOXD1、TBX2和OVOL1（圖5j）。對(duì)于比例變化較大的細(xì)胞類型（Tregs、Th17、Act b、SMB、USMB和中性粒細(xì)胞），回顧了這些細(xì)胞中DEGs的功能結(jié)果，發(fā)現(xiàn)它們都與病毒感染相關(guān)（圖5k）。因此，收集了20例IC患者和14例對(duì)照者的尿液標(biāo)本進(jìn)行病毒檢測(cè)。人多瘤病毒-2在IC尿液中檢出陽性率為95%（19/20），而在對(duì)照組尿液中未檢出（圖5l）。這一發(fā)現(xiàn)將為IC的病因?qū)W和病理生理機(jī)制提供新的線索和理論依據(jù)，今后還需要更多的工作和研究來深入研究感染的細(xì)胞類型及其關(guān)鍵受體，從而找到治療IC的潛在靶點(diǎn)。

圖5基于scRNA-seq的Cellphone DB分析顯示了免疫網(wǎng)絡(luò)中的串?dāng)_

6. ST顯示IC尿路上皮內(nèi)有免疫細(xì)胞聚集阻斷劑在卵巢癌發(fā)生中的作用

為了生成組織切片的無偏倚轉(zhuǎn)錄組圖，將來自3例IC患者的6個(gè)膀胱組織樣本和來自對(duì)照組的3個(gè)樣本安裝在空間條形碼ST芯片載玻片上。切片經(jīng)H&E染色及brightfield成像，觀察其組織學(xué)特征。經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制后，采用Seurat方法進(jìn)行降維，并通過T-SNE實(shí)現(xiàn)可視化。根據(jù)每個(gè)簇中的DEGs，進(jìn)行逐步細(xì)胞聚類構(gòu)建ST圖。圖6a展示了IC膀胱的第一個(gè)ST圖?；蚝蚒MIs之間有很強(qiáng)的相關(guān)性（圖6b）。檢測(cè)了平滑肌細(xì)胞（SMCs）、尿路上皮細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞（ISCs）和肥大細(xì)胞（KIT）的標(biāo)記基因（圖6c）。圖6d描繪了完整的膀胱壁結(jié)構(gòu)，包括尿路上皮區(qū)、固有層和肌肉層（圖6d）。FN1、TGF-β1、COL1A1和COL3A1在內(nèi)的纖維化基因在各種細(xì)胞類型中均高表達(dá)，這可能表明膀胱結(jié)構(gòu)可能最終發(fā)生重度纖維化（圖6e）。圖6g顯示對(duì)照膀胱的第一個(gè)ST圖。基因和UMIs之間的相關(guān)系數(shù)為0.98（圖6h）。鑒定了平滑肌細(xì)胞、ISCs、成纖維細(xì)胞（COL1A2）、肌成纖維細(xì)胞和尿路上皮細(xì)胞（圖6i, j）。然而，在對(duì)照組細(xì)胞中，纖維化基因的表達(dá)水平較低（圖6k）。

圖6利用多模態(tài)交叉分析（MIA）繪制IC膀胱切片不同免疫群體的分布圖

7.免疫亞群圖譜揭示了IC和對(duì)照膀胱組織中免疫細(xì)胞的分布差異

為了精確定位免疫細(xì)胞在IC膀胱中的位置，應(yīng)用多模態(tài)交集分析（MIA）來解釋不同組織之間的空間限制性映射。結(jié)果顯示，幾乎所有的免疫亞群，如巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、駐留記憶CD8+ T細(xì)胞、漿細(xì)胞、PDC、CDCS、NKT細(xì)胞、初始B細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，在IC膀胱的尿路上皮區(qū)域富集或位于成纖維細(xì)胞附近（圖6f），也在對(duì)照膀胱的尿路上皮和平滑肌細(xì)胞周圍發(fā)現(xiàn)（圖6l）。但其中只有一半的免疫細(xì)胞亞群在對(duì)照膀胱的尿路上皮區(qū)域被識(shí)別。MIA的研究結(jié)果證實(shí)了上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在IC的發(fā)生發(fā)展中的重要作用，CellPhone DB數(shù)據(jù)庫也提示了這一點(diǎn)。綜上所述，作者成功構(gòu)建了IC膀胱在空間水平上的免疫圖譜，并表征了IC膀胱的免疫網(wǎng)絡(luò)。

結(jié)論：

作者構(gòu)建了女性IC患者膀胱的免疫景觀，確定了這些免疫細(xì)胞亞群的特征，并闡述了它們之間的關(guān)系和相互作用。該研究為IC的免疫圖譜研究開創(chuàng)了先例。免疫系統(tǒng)的研究可能會(huì)對(duì)IC的病理生理機(jī)制提供更深入的了解，并為未來該病的診斷和治療奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

Peng L, Jin X, Li BY, Zeng X, Liao BH, Jin T, Chen JW, Gao XS, Wang W, He Q, Chen G, Gong LN, Shen H, Wang KJ, Li H, Luo DY. Integrating single-cell RNA sequencing with spatial transcriptomics reveals immune landscape for interstitial cystitis. Signal Transduct Target Ther. 2022; 7(1):161. doi: 10.1038/s41392-022-00962-8.