CircBCAR3通過海綿化miR-27a-3p加速食管癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移
食管癌是一種全球致命的癌癥，5年生存率為18%。目前環(huán)狀RNA(circRNAs)已被證實(shí)有助于食管癌的進(jìn)展。在本研究中，作者通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)circBCAR3(hsa_circ_0007624)在食管癌中存在差異表達(dá)，進(jìn)而研究circBCAR3在食管癌發(fā)生中的致癌作用和生物發(fā)生。該研究于2022年7月發(fā)表在《Molecular Cancer》，IF：15.302。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1. CircBCAR3在食管癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)
為了解circBCAR3在食管癌中的表達(dá)情況，首先從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中分析了circRNAs在食管癌中的表達(dá)情況。基于GSE150476和GSE112496數(shù)據(jù)集，食管癌中存在5種差異表達(dá)的circRNAs(圖1A)。在EC109細(xì)胞中，缺氧治療后只有hsa_circ_007624表達(dá)上調(diào)(圖1B)。PCR結(jié)果顯示hsa_circ_0007624(circBCAR3)在食管腫瘤組織和細(xì)胞系中表達(dá)明顯升高，證實(shí)circBCAR3表達(dá)上調(diào)(圖1C和D)。將BCAR3 pe-mRNA的2，3，4，5外顯子反向剪接，形成circBCAR3的閉環(huán)結(jié)構(gòu)(圖1E)。作者檢測(cè)了circBCAR3和線性BCAR3與RNase R的穩(wěn)定性，環(huán)狀形式(circBCAR3)對(duì)RNase R的抗性更強(qiáng)，而線性形式(BCAR3 mRNA)顯著衰減(圖1F)。此外，經(jīng)轉(zhuǎn)錄抑制劑Actinomycin D處理后，circBCAR3的轉(zhuǎn)錄半衰期長(zhǎng)于BCAR3 mRNA，這表明circBCAR3的穩(wěn)定性高于BCAR3 mRNA(圖1G)。通過瓊脂糖凝膠電泳分析從EC109和KYSE150細(xì)胞中分離cDNA和gDNA。利用cDNA而非gDNA中的不同引物擴(kuò)增circBCAR3，證實(shí)環(huán)狀BCAR3外顯子的存在，排除了反式剪接產(chǎn)物(圖1H)。隨后對(duì)EC109和KYSE150細(xì)胞進(jìn)行了RNA-FISH檢測(cè)，結(jié)果顯示circBCAR3主要存在于食管癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(圖1I)。
圖1. CircBCAR3在食管癌中表達(dá)上調(diào)
2. 敲低circBCAR3可抑制食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲
探討circBCAR3在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用，在EC109和KYSE150細(xì)胞中，作者設(shè)計(jì)了兩種shRNAs來有效地沉默circBCAR3(圖2A)。CCK-8、克隆形成實(shí)驗(yàn)和EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默的circBCAR3抑制了EC109和KYSE150細(xì)胞的活力和增殖(圖2B-D)。創(chuàng)面愈合試驗(yàn)和transwell試驗(yàn)(包括遷移和侵襲)表明，circBCAR3的下調(diào)抑制了食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力(圖2E和F)。
圖2. 沉默circBCAR3在體外可抑制食管癌細(xì)胞的增殖和運(yùn)動(dòng)
3. 敲低circBCAR3可抑制食管癌細(xì)胞的鐵死亡
接下來，作者進(jìn)一步探討敲低circBCAR3對(duì)鐵死亡的影響。如圖3A-D所示，sh-circBCAR3降低了細(xì)胞內(nèi)Fe2+、MDA、脂質(zhì)ROS，并增加了GSH水平。透射電鏡觀察sh-circBCAR3在食管癌細(xì)胞中還原鐵死亡的典型形態(tài)變化(圖3E)。如圖3F所示，沉默circBCAR3后，GPX4蛋白水平升高。因此，circBCAR3的敲低可抑制食管癌細(xì)胞的鐵死亡。
圖3. 沉默circBCAR3在體外可抑制食管癌細(xì)胞的鐵死亡
4. 敲低circBCAR3可逆轉(zhuǎn)缺氧對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和鐵死亡的影響
再次進(jìn)行功能研究，以評(píng)估circBCAR3是否介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞惡性行為的改變。結(jié)果表明，缺氧處理可顯著促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和鐵死亡，CircBCAR3基因的下調(diào)明顯逆轉(zhuǎn)了缺氧的這些影響(圖4)。
圖4. 敲低circBCAR3可逆轉(zhuǎn)缺氧對(duì)體外食管癌細(xì)胞的影響
5. 沉默circBCAR3在體內(nèi)可抑制食管癌的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移
如圖5A-C，結(jié)果表明敲低circBCAR3可降低小鼠食管腫瘤的體積和重量。此外，免疫組化染色結(jié)果表明，沉默的circBCAR3可降低增殖標(biāo)志物ki67的表達(dá)。H&E染色結(jié)果顯示，sh-nc組腫瘤細(xì)胞分布密集，細(xì)胞形態(tài)正常，而sh-circBCAR3組腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞核縮小較多(圖5D)。隨后，作者建立腫瘤轉(zhuǎn)移模型，通過尾靜脈注射食管癌細(xì)胞來監(jiān)測(cè)肺轉(zhuǎn)移。生物發(fā)光強(qiáng)度的下降證明沉默的circBCAR3誘導(dǎo)小鼠腫瘤抑制(圖5E)。與對(duì)照組相比，沉默circBCAR3對(duì)食管癌肺轉(zhuǎn)移有抑制作用(圖5F)。H&E染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一趨勢(shì)(圖5G)。免疫組化染色揭示敲除circBCAR3可抑制肺組織中vimentin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)(圖5H)。這些數(shù)據(jù)表明，在體內(nèi)敲低circBCAR3可抑制食管癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
圖5. 敲低circBCAR3在體內(nèi)可抑制食管癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移
6. 在食管癌細(xì)胞中，circBCAR3負(fù)向調(diào)控miR-27a-3p
從ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)與circBCAR3結(jié)合的潛在miRNAs。miR-27a-3p與circBCAR3的結(jié)合位點(diǎn)如圖6A所示。熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，circBCAR3負(fù)調(diào)控野生型miR-27a-3p，與突變型miR-27a-3p無結(jié)合關(guān)系(圖6B)。RIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ago2是miRNA機(jī)制的效應(yīng)物，可與miR-27a-3p和circBCAR3結(jié)合(圖6C和D)。轉(zhuǎn)染circBCAR3 shRNAs到EC109和KYSE150細(xì)胞，miR-27a-3p表達(dá)水平升高，而過表達(dá)circBCAR3降低了miR-27a-3p的表達(dá)水平(圖6E)。此外，為確定circBCAR3和miR-27a-3p在食管癌細(xì)胞中的亞細(xì)胞分布，作者進(jìn)行了RNA-FISH實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明circBCAR3和miR-27a-3p均位于細(xì)胞質(zhì)中(圖6F)。
圖6. CircBCAR3在食管癌細(xì)胞中充當(dāng)miR-27a-3p的海綿
7. TNPO1在食管癌細(xì)胞中作為miR-27a-3p的靶點(diǎn)
通過ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)，確定TNPO1、GCC2、THRB和CASC3為miR-27a-3p的潛在靶點(diǎn)。圖7A結(jié)果表明，miR-27a-3p可引起TNPO1在EC109細(xì)胞中的表達(dá)降低。與對(duì)照Het-1A細(xì)胞系相比，6個(gè)食管癌細(xì)胞中TNPO1表達(dá)顯著上調(diào)(圖7B)。從GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)，TNPO1在182個(gè)食管癌組織中表達(dá)高于286個(gè)相鄰非腫瘤組織(圖7C)。根據(jù)ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，TNPO1 3'UTR與miR-27a-3p序列互補(bǔ)(圖7D)。構(gòu)建TNPO1 3'UTR野生型和突變型熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)行熒光素酶實(shí)驗(yàn)，證實(shí)TNPO1是miR-27a-3p的直接靶點(diǎn)(圖7E)。MiR-27a-3p模擬物能有效降低TNPO1的表達(dá)水平，而miR-27a-3p抑制劑能顯著增強(qiáng)TNPO1的表達(dá)水平(圖7F)。缺氧可誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞中TNPO1表達(dá)上調(diào)(圖7G)。PCR結(jié)果顯示，與45個(gè)癌旁非腫瘤組織相比，TNPO1在45個(gè)食管癌組織中顯著高表達(dá)(圖7H)。
圖7. TNPO1在食管癌細(xì)胞中作為miR-27a-3p的靶點(diǎn)
8. 過表達(dá)TNPO1可拯救沉默circBCAR3介導(dǎo)的對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和鐵死亡的抑制
作者設(shè)計(jì)了TNPO1過表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)它有效地拯救了sh-circBCAR3對(duì)TNPO1表達(dá)的抑制作用(圖8A)。集落形成實(shí)驗(yàn)和EdU實(shí)驗(yàn)表明，circBCAR3 shRNA降低細(xì)胞活力和增殖，TNPO1過表達(dá)進(jìn)一步提高細(xì)胞活力和增殖(圖8B和C)。Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)表明，TNPO1過表達(dá)挽救了敲低circBCAR3對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用(圖8D)。圖9顯示sh-circBCAR3對(duì)食管癌細(xì)胞鐵死亡的抑制作用被TNPO1的過表達(dá)所拯救，pcDNA-TNPO1-誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Fe2+、MDA、脂質(zhì)ROS升高，GSH和GPX4水平降低。
圖8. TNPO1可逆轉(zhuǎn)circBCAR3沉默誘導(dǎo)的對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和活力的抑制
圖9. TNPO1挽救sh-circBCAR3誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞鐵死亡抑制
9. 剪接因子QKI加速circBCAR3的生物發(fā)生
PCR分析結(jié)果顯示，剪接因子QKI和ESRP1對(duì)食管癌細(xì)胞中circBCAR3的表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用，而其他剪接因子對(duì)circBCAR3的表達(dá)無顯著影響(圖10A)。接下來展示了5個(gè)QKI結(jié)合序列位于BCAR3 pre-mRNA外顯子的兩側(cè)(圖10B)。RIP試驗(yàn)使用QKI抗體證明QKI與BCAR3 pre-mRNA在a，b，d和e位點(diǎn)結(jié)合(圖10C)。此外，QKI在收集的45個(gè)食管癌組織中表達(dá)上調(diào)(圖10D)。敲低QKI可以抑制circBCAR3的表達(dá)，對(duì)BCAR3 mRNA的表達(dá)無影響(圖10E)。這些發(fā)現(xiàn)表明，剪接因子QKI通過內(nèi)含子中的結(jié)合位點(diǎn)加速了circBCAR3的生物發(fā)生。
圖10. 剪接因子QKI加速circBCAR3的生物發(fā)生
10. 缺氧誘導(dǎo)E2F7表達(dá)激活QKI轉(zhuǎn)錄
作者已經(jīng)證實(shí)，circBCAR3在食管癌中高表達(dá)，并通過缺氧治療上調(diào)表達(dá)。缺氧如何誘導(dǎo)circBCAR3表達(dá)升高尚不清楚。因此，進(jìn)行RNA-seq篩選異常基因，如熱圖和火山圖所示(圖11A和B)。富集分析顯示E2F家族的基因被富集(圖11C)。通過檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)來探討這些E2Fs在食管癌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)E2F7在食管癌中顯著高表達(dá)(圖11D)。PCR分析證實(shí)，缺氧后EC109細(xì)胞E2F7和QKI表達(dá)均上調(diào)(圖11E)。由于E2F7是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子，推測(cè)E2F7可能調(diào)控QKI的轉(zhuǎn)錄。在QKI的啟動(dòng)子中，基于JASPR在線數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)E2F7的潛在結(jié)合位點(diǎn)(圖11F)。隨后，將該結(jié)合位點(diǎn)的野生和突變形式亞克隆到pGL3載體中。熒光素酶測(cè)定后，結(jié)果表明，E2F7對(duì)攜帶野生結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告載體熒光素酶活性有促進(jìn)作用，但對(duì)突變位點(diǎn)無促進(jìn)作用(圖11G)。此外，E2F7基因敲除降低了QKI mRNA表達(dá)水平(圖11H)。檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)，在182個(gè)食管癌組織中檢測(cè)這些關(guān)鍵分子的表達(dá)相關(guān)性，結(jié)果顯示E2F7和QKI，E2F7和TNPO1，QKI和TNPO1兩者之間存在正相關(guān)表達(dá)(圖11I)。
圖11. 缺氧誘導(dǎo)E2F7激活QKI的轉(zhuǎn)錄
結(jié)論：
作者創(chuàng)新性地證明了circBCAR3在食管癌中的致癌作用，通過促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和鐵死亡以及促進(jìn)小鼠食管癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。在分子水平上，缺氧誘導(dǎo)的E2F7轉(zhuǎn)錄激活剪接因子QKI，通過與內(nèi)含子結(jié)合促進(jìn)circBCAR3的生物發(fā)生形成circBCAR3外顯子側(cè)面的QKI響應(yīng)元件。CircBCAR3與miR-27a-3p相互作用上調(diào)TNPO1，從而在食管癌細(xì)胞中發(fā)揮其生物學(xué)功能。這些數(shù)據(jù)表明，circBCAR3可作為食管癌研究和治療的潛在標(biāo)志物。