CircBCAR3通過海綿化miR-27a-3p加速食管癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移

食管癌是一種全球致命的癌癥，5年生存率為18%。目前環(huán)狀RNA(circRNAs)已被證實有助于食管癌的進展。在本研究中，作者通過生物信息學分析預測circBCAR3(hsa_circ_0007624)在食管癌中存在差異表達，進而研究circBCAR3在食管癌發(fā)生中的致癌作用和生物發(fā)生。該研究于2022年7月發(fā)表在《Molecular Cancer》，IF：15.302。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. CircBCAR3在食管癌組織和細胞中表達上調(diào)

為了解circBCAR3在食管癌中的表達情況，首先從GEO數(shù)據(jù)庫中分析了circRNAs在食管癌中的表達情況?；贕SE150476和GSE112496數(shù)據(jù)集，食管癌中存在5種差異表達的circRNAs(圖1A)。在EC109細胞中，缺氧治療后只有hsa_circ_007624表達上調(diào)(圖1B)。PCR結(jié)果顯示hsa_circ_0007624(circBCAR3)在食管腫瘤組織和細胞系中表達明顯升高，證實circBCAR3表達上調(diào)(圖1C和D)。將BCAR3 pe-mRNA的2，3，4，5外顯子反向剪接，形成circBCAR3的閉環(huán)結(jié)構(gòu)(圖1E)。作者檢測了circBCAR3和線性BCAR3與RNase R的穩(wěn)定性，環(huán)狀形式(circBCAR3)對RNase R的抗性更強，而線性形式(BCAR3 mRNA)顯著衰減(圖1F)。此外，經(jīng)轉(zhuǎn)錄抑制劑Actinomycin D處理后，circBCAR3的轉(zhuǎn)錄半衰期長于BCAR3 mRNA，這表明circBCAR3的穩(wěn)定性高于BCAR3 mRNA(圖1G)。通過瓊脂糖凝膠電泳分析從EC109和KYSE150細胞中分離cDNA和gDNA。利用cDNA而非gDNA中的不同引物擴增circBCAR3，證實環(huán)狀BCAR3外顯子的存在，排除了反式剪接產(chǎn)物(圖1H)。隨后對EC109和KYSE150細胞進行了RNA-FISH檢測，結(jié)果顯示circBCAR3主要存在于食管癌細胞的細胞質(zhì)中(圖1I)。

圖1. CircBCAR3在食管癌中表達上調(diào)

2. 敲低circBCAR3可抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲

探討circBCAR3在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用，在EC109和KYSE150細胞中，作者設(shè)計了兩種shRNAs來有效地沉默circBCAR3(圖2A)。CCK-8、克隆形成實驗和EdU實驗結(jié)果顯示，沉默的circBCAR3抑制了EC109和KYSE150細胞的活力和增殖(圖2B-D)。創(chuàng)面愈合試驗和transwell試驗(包括遷移和侵襲)表明，circBCAR3的下調(diào)抑制了食管癌細胞的遷移和侵襲能力(圖2E和F)。

圖2. 沉默circBCAR3在體外可抑制食管癌細胞的增殖和運動

3. 敲低circBCAR3可抑制食管癌細胞的鐵死亡

接下來，作者進一步探討敲低circBCAR3對鐵死亡的影響。如圖3A-D所示，sh-circBCAR3降低了細胞內(nèi)Fe2+、MDA、脂質(zhì)ROS，并增加了GSH水平。透射電鏡觀察sh-circBCAR3在食管癌細胞中還原鐵死亡的典型形態(tài)變化(圖3E)。如圖3F所示，沉默circBCAR3后，GPX4蛋白水平升高。因此，circBCAR3的敲低可抑制食管癌細胞的鐵死亡。

圖3. 沉默circBCAR3在體外可抑制食管癌細胞的鐵死亡

4. 敲低circBCAR3可逆轉(zhuǎn)缺氧對食管癌細胞增殖、遷移、侵襲和鐵死亡的影響

再次進行功能研究，以評估circBCAR3是否介導缺氧誘導的食管癌細胞惡性行為的改變。結(jié)果表明，缺氧處理可顯著促進食管癌細胞的增殖、遷移、侵襲和鐵死亡，CircBCAR3基因的下調(diào)明顯逆轉(zhuǎn)了缺氧的這些影響(圖4)。

圖4. 敲低circBCAR3可逆轉(zhuǎn)缺氧對體外食管癌細胞的影響

5. 沉默circBCAR3在體內(nèi)可抑制食管癌的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移

如圖5A-C，結(jié)果表明敲低circBCAR3可降低小鼠食管腫瘤的體積和重量。此外，免疫組化染色結(jié)果表明，沉默的circBCAR3可降低增殖標志物ki67的表達。H&E染色結(jié)果顯示，sh-nc組腫瘤細胞分布密集，細胞形態(tài)正常，而sh-circBCAR3組腫瘤細胞數(shù)量減少，細胞核縮小較多(圖5D)。隨后，作者建立腫瘤轉(zhuǎn)移模型，通過尾靜脈注射食管癌細胞來監(jiān)測肺轉(zhuǎn)移。生物發(fā)光強度的下降證明沉默的circBCAR3誘導小鼠腫瘤抑制(圖5E)。與對照組相比，沉默circBCAR3對食管癌肺轉(zhuǎn)移有抑制作用(圖5F)。H&E染色結(jié)果進一步證實了這一趨勢(圖5G)。免疫組化染色揭示敲除circBCAR3可抑制肺組織中vimentin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9的表達，促進E-cadherin的表達(圖5H)。這些數(shù)據(jù)表明，在體內(nèi)敲低circBCAR3可抑制食管癌的生長和轉(zhuǎn)移。

圖5. 敲低circBCAR3在體內(nèi)可抑制食管癌的生長和轉(zhuǎn)移

6. 在食管癌細胞中，circBCAR3負向調(diào)控miR-27a-3p

從ENCORI數(shù)據(jù)庫中預測與circBCAR3結(jié)合的潛在miRNAs。miR-27a-3p與circBCAR3的結(jié)合位點如圖6A所示。熒光素酶實驗結(jié)果顯示，circBCAR3負調(diào)控野生型miR-27a-3p，與突變型miR-27a-3p無結(jié)合關(guān)系(圖6B)。RIP實驗發(fā)現(xiàn)，Ago2是miRNA機制的效應(yīng)物，可與miR-27a-3p和circBCAR3結(jié)合(圖6C和D)。轉(zhuǎn)染circBCAR3 shRNAs到EC109和KYSE150細胞，miR-27a-3p表達水平升高，而過表達circBCAR3降低了miR-27a-3p的表達水平(圖6E)。此外，為確定circBCAR3和miR-27a-3p在食管癌細胞中的亞細胞分布，作者進行了RNA-FISH實驗，結(jié)果表明circBCAR3和miR-27a-3p均位于細胞質(zhì)中(圖6F)。

圖6. CircBCAR3在食管癌細胞中充當miR-27a-3p的海綿

7. TNPO1在食管癌細胞中作為miR-27a-3p的靶點

通過ENCORI數(shù)據(jù)庫，確定TNPO1、GCC2、THRB和CASC3為miR-27a-3p的潛在靶點。圖7A結(jié)果表明，miR-27a-3p可引起TNPO1在EC109細胞中的表達降低。與對照Het-1A細胞系相比，6個食管癌細胞中TNPO1表達顯著上調(diào)(圖7B)。從GEPIA數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，TNPO1在182個食管癌組織中表達高于286個相鄰非腫瘤組織(圖7C)。根據(jù)ENCORI數(shù)據(jù)庫預測，TNPO1 3'UTR與miR-27a-3p序列互補(圖7D)。構(gòu)建TNPO1 3'UTR野生型和突變型熒光素酶報告基因進行熒光素酶實驗，證實TNPO1是miR-27a-3p的直接靶點(圖7E)。MiR-27a-3p模擬物能有效降低TNPO1的表達水平，而miR-27a-3p抑制劑能顯著增強TNPO1的表達水平(圖7F)。缺氧可誘導食管癌細胞中TNPO1表達上調(diào)(圖7G)。PCR結(jié)果顯示，與45個癌旁非腫瘤組織相比，TNPO1在45個食管癌組織中顯著高表達(圖7H)。

圖7. TNPO1在食管癌細胞中作為miR-27a-3p的靶點

8. 過表達TNPO1可拯救沉默circBCAR3介導的對食管癌細胞增殖、遷移、侵襲和鐵死亡的抑制

作者設(shè)計了TNPO1過表達載體，發(fā)現(xiàn)它有效地拯救了sh-circBCAR3對TNPO1表達的抑制作用(圖8A)。集落形成實驗和EdU實驗表明，circBCAR3 shRNA降低細胞活力和增殖，TNPO1過表達進一步提高細胞活力和增殖(圖8B和C)。Transwell遷移和侵襲實驗表明，TNPO1過表達挽救了敲低circBCAR3對細胞遷移和侵襲能力的抑制作用(圖8D)。圖9顯示sh-circBCAR3對食管癌細胞鐵死亡的抑制作用被TNPO1的過表達所拯救，pcDNA-TNPO1-誘導細胞內(nèi)Fe2+、MDA、脂質(zhì)ROS升高，GSH和GPX4水平降低。

圖8. TNPO1可逆轉(zhuǎn)circBCAR3沉默誘導的對食管癌細胞增殖和活力的抑制

圖9. TNPO1挽救sh-circBCAR3誘導的食管癌細胞鐵死亡抑制

9. 剪接因子QKI加速circBCAR3的生物發(fā)生

PCR分析結(jié)果顯示，剪接因子QKI和ESRP1對食管癌細胞中circBCAR3的表達有負調(diào)控作用，而其他剪接因子對circBCAR3的表達無顯著影響(圖10A)。接下來展示了5個QKI結(jié)合序列位于BCAR3 pre-mRNA外顯子的兩側(cè)(圖10B)。RIP試驗使用QKI抗體證明QKI與BCAR3 pre-mRNA在a，b，d和e位點結(jié)合(圖10C)。此外，QKI在收集的45個食管癌組織中表達上調(diào)(圖10D)。敲低QKI可以抑制circBCAR3的表達，對BCAR3 mRNA的表達無影響(圖10E)。這些發(fā)現(xiàn)表明，剪接因子QKI通過內(nèi)含子中的結(jié)合位點加速了circBCAR3的生物發(fā)生。

圖10. 剪接因子QKI加速circBCAR3的生物發(fā)生

10. 缺氧誘導E2F7表達激活QKI轉(zhuǎn)錄

作者已經(jīng)證實，circBCAR3在食管癌中高表達，并通過缺氧治療上調(diào)表達。缺氧如何誘導circBCAR3表達升高尚不清楚。因此，進行RNA-seq篩選異?；颍鐭釄D和火山圖所示(圖11A和B)。富集分析顯示E2F家族的基因被富集(圖11C)。通過檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫來探討這些E2Fs在食管癌中的表達，發(fā)現(xiàn)E2F7在食管癌中顯著高表達(圖11D)。PCR分析證實，缺氧后EC109細胞E2F7和QKI表達均上調(diào)(圖11E)。由于E2F7是一個轉(zhuǎn)錄激活因子，推測E2F7可能調(diào)控QKI的轉(zhuǎn)錄。在QKI的啟動子中，基于JASPR在線數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)了一個E2F7的潛在結(jié)合位點(圖11F)。隨后，將該結(jié)合位點的野生和突變形式亞克隆到pGL3載體中。熒光素酶測定后，結(jié)果表明，E2F7對攜帶野生結(jié)合位點的報告載體熒光素酶活性有促進作用，但對突變位點無促進作用(圖11G)。此外，E2F7基因敲除降低了QKI mRNA表達水平(圖11H)。檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫，在182個食管癌組織中檢測這些關(guān)鍵分子的表達相關(guān)性，結(jié)果顯示E2F7和QKI，E2F7和TNPO1，QKI和TNPO1兩者之間存在正相關(guān)表達(圖11I)。

圖11. 缺氧誘導E2F7激活QKI的轉(zhuǎn)錄

結(jié)論：

作者創(chuàng)新性地證明了circBCAR3在食管癌中的致癌作用，通過促進癌細胞增殖、遷移、侵襲和鐵死亡以及促進小鼠食管癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。在分子水平上，缺氧誘導的E2F7轉(zhuǎn)錄激活剪接因子QKI，通過與內(nèi)含子結(jié)合促進circBCAR3的生物發(fā)生形成circBCAR3外顯子側(cè)面的QKI響應(yīng)元件。CircBCAR3與miR-27a-3p相互作用上調(diào)TNPO1，從而在食管癌細胞中發(fā)揮其生物學功能。這些數(shù)據(jù)表明，circBCAR3可作為食管癌研究和治療的潛在標志物。