環(huán)狀RNA Cwc27通過(guò)抑制Pur-α活性促進(jìn)阿爾茨海默癥發(fā)病機(jī)制

環(huán)狀RNA(circRNAs)在參與各種生物過(guò)程和參考多種疾病方面受到越來(lái)越多的關(guān)注。雖然阿爾茨海默癥(AD)中差異表達(dá)的circRNA已經(jīng)建立，但與AD直接相關(guān)的關(guān)鍵circRNA在基因表達(dá)和疾病相關(guān)認(rèn)知中的精確特征和功能尚不清楚。在此，作者篩選并鑒定了circCwc27這一與AD相關(guān)的新型circRNA。該研究于2022年2月發(fā)表在《Cell Death Differentiation》，IF：10.717。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. CircCwc27在AD中上調(diào)

作者的目標(biāo)是篩選AD早期有希望的circRNA，收集6月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因和WT對(duì)照小鼠海馬體。共有131個(gè)circRNA顯著失調(diào)，熱圖中顯示了上調(diào)和下調(diào)最高的15個(gè)circRNA(圖1A)。在這30個(gè)circRNA中，Rybak-Wolf等人鑒定出13個(gè)在人和小鼠之間保守的circRNA。APP/PS1小鼠和WT小鼠的海馬體比較中，有4個(gè)circRNA顯著上調(diào)，4個(gè)circRNA顯著下調(diào)(圖1B)。在APP/PS1小鼠的海馬區(qū)觀察到AD患者的顳葉皮質(zhì)和血漿中檢測(cè)到circCwc27(mmu_circ_0004423)明顯升高(圖1C)，并且在海馬區(qū)表達(dá)量最高(圖1D)。

2. CircCwc27是一個(gè)豐富、穩(wěn)定的circRNA，主要定位于神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)中

在大腦皮層和海馬體中觀察到circCwc27高度表達(dá)，這是大腦中兩個(gè)脆弱的區(qū)域(圖1E)。此外，在APP/PS1小鼠和WT小鼠的大腦中，circCwc27主要表達(dá)在神經(jīng)元而非神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中(圖1F和G)。同時(shí)檢測(cè)了circCwc27的絕對(duì)拷貝數(shù)，結(jié)果顯示，每個(gè)人的海馬神經(jīng)元中平均有98個(gè)circCwc27拷貝，SH-SY5Y細(xì)胞中有78個(gè)circCwc27拷貝(圖1H)。

圖1. CircCwc27是一個(gè)高度豐富且穩(wěn)定的circRNA，在AD中表達(dá)上調(diào)

3. 在APP/PS1小鼠中敲除circCwc27可改善兒童的認(rèn)知能力下降

將表達(dá)shRNA circCon-GFP(LV-sh-circCon)或shRNA circCwc27-GFP(LV-sh-circCwc27)的慢病毒微注射到9月齡小鼠側(cè)腦室，2個(gè)月后分析小鼠的記憶和空間學(xué)習(xí)能力(圖2A)。綠色熒光蛋白(GFP)信號(hào)主要分布在整個(gè)皮層和海馬區(qū)，并與神經(jīng)元共定位(圖2B和C)。CircCwc27表達(dá)顯著下調(diào)，慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后Cwc27水平保持不變(圖2D)。Y迷宮自發(fā)交替行為測(cè)試顯示APP/PS1小鼠微注射LV-sh-circCon后，交替性明顯下降，而抑制circCwc27則能顯著阻止這種下降(圖2E)。組間相同的條目數(shù)不支持運(yùn)動(dòng)功能缺損(圖2F)。

在訓(xùn)練階段，APP/PS1小鼠中微注射LV-sh-circCon，發(fā)現(xiàn)隱藏平臺(tái)的潛伏期明顯延長(zhǎng)，而微注射LV-sh-circCwc27提高了學(xué)習(xí)能力(圖2G和H)。在探針試驗(yàn)中，記憶保持是通過(guò)在包含隱藏平臺(tái)的象限所花費(fèi)的時(shí)間來(lái)衡量的。結(jié)果表明，下調(diào)circCwc27可以改善APP/PS1小鼠的空間記憶(圖2I和K)。另外，所有組小鼠的游泳速度都相似(圖2J)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，敲除circCwc27在很大程度上改善了AD的認(rèn)知衰退。

圖2. 在APP/PS1小鼠模型中敲除circCwc27可改善空間學(xué)習(xí)記憶

4. 在APP/PS1小鼠中，下調(diào)circCwc27可防止Aβ沉積及相關(guān)神經(jīng)退行性影響

應(yīng)用Aβ抗體(NAB228)對(duì)APP/PS1小鼠腦組織進(jìn)行染色，結(jié)果顯示微注射LV-sh-circCwc27明顯降低了斑塊負(fù)荷(圖3A)。注射LV-sh-circCwc27后，大腦皮層和海馬區(qū)可溶性和不可溶性Aβ40和Aβ42水平均持續(xù)下降(圖3B-E)。此外，觀察到circCwc27的表達(dá)與APP/PS1小鼠組Aβ40(圖3F)或Aβ42水平(圖3G)成正相關(guān)。在小鼠海馬中微注射LV-sh-circCwc27，Aβ與營(yíng)養(yǎng)不良神經(jīng)細(xì)胞共定位的區(qū)域顯著減少(圖3H)。WT小鼠微注射LV-sh-circCwc27不影響突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)，而APP/PS1小鼠明顯抑制其下降(圖3I)。APP/PS1小鼠微注射LV-sh-circCwc27可顯著降低小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化(圖3J)。上述結(jié)果表明，circCwc27基因的下調(diào)在AD的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性作用中發(fā)揮了保護(hù)作用。

圖3. 敲除circCwc27可改善APP/PS1小鼠的AD病理

5. CircCwc27直接與Pur-α蛋白結(jié)合并影響其分布

下一步的目標(biāo)是闡明circCwc27引起AD病理的分子機(jī)制。通過(guò)RNA免疫沉淀(RIP)，觀察到內(nèi)源性circCwc27沒(méi)有在AGO2上富集(圖4A)。因此，進(jìn)行RNA下拉分析和質(zhì)譜(MS)分析，在APP/PS1小鼠海馬中尋找潛在的circCwc27相互作用的蛋白(圖4B)。共有154個(gè)蛋白被circCwc27連接探針拉下，這些蛋白大多在大腦中富集。GO富集分析顯示，這些蛋白大多與RNA/DNA結(jié)合相關(guān)(圖4C)。

RIP檢測(cè)結(jié)果表明，Pur-α抗體和HNRNPK抗體可拉低circCwc27，而不是SH-SY5Y細(xì)胞中的其他三個(gè)候選者(圖4D)。RNA下拉結(jié)果也驗(yàn)證了circCwc27與Pur-α的直接相互作用(圖4E)。再進(jìn)一步驗(yàn)證了circCwc27與Pur-α的內(nèi)源性共定位(圖4F)。RIP檢測(cè)結(jié)果顯示，與circCwc27直接結(jié)合的只有PUR重復(fù)結(jié)構(gòu)域(66-246aa)，沒(méi)有其他結(jié)構(gòu)域(圖4G)。

與WT小鼠相比，APP/PS1和APP/PS1-LV-sh-circCon小鼠海馬區(qū)circCwc27介導(dǎo)的Pur-α水平顯著上調(diào)(圖4H)。敲除circCwc27在APP/PS1小鼠能顯著降低circCwc27與Pur-α的結(jié)合(圖4H)。在RIP測(cè)定中也得到了類(lèi)似的結(jié)果(圖4I)。免疫印跡結(jié)果顯示，APP/PS1小鼠細(xì)胞核Pur-α表達(dá)明顯降低，胞漿Pur-α表達(dá)增加(圖4J和K)。注射LV-sh-circCwc27可顯著促進(jìn)Pur-α的核分布(圖4J和K)?？傊Y(jié)果表明，增加circCwc27與Pur-α相互作用并將其捕獲在細(xì)胞質(zhì)中，而敲除circCwc27可促進(jìn)Pur-α的核轉(zhuǎn)位。

圖4. CircCwc27與Pur-α蛋白相互作用并影響其分布

6. Pur-α降低Aβ負(fù)荷，防止AD患者認(rèn)知能力下降

將攜帶Flag-labeled Control-GFP(Flag-AAV9-Control)或Pur-α(Flag-AAV9-Pur-α)的腺相關(guān)病毒制劑微注射到APP/PS1小鼠海馬中，觀察Pur-α對(duì)AD病理的影響。立體定向注射兩個(gè)月后，海馬區(qū)出現(xiàn)明顯的綠色熒光和約42 kDa的Flag表達(dá)，表明有效的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖5A-C)。值得注意的是，在Pur-α過(guò)表達(dá)的大腦中，circCwc27的表達(dá)沒(méi)有變化(圖5D)。與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)Pur-α可顯著減少APP/PS1小鼠海馬區(qū)Aβ沉積和促炎細(xì)胞因子(圖5E和F)。微注射Flag-AAV9-Pur-α在很大程度上保護(hù)APP/PS1小鼠的記憶形成嚴(yán)重缺陷(圖5G-I)。綜上所述，這些結(jié)果表明Pur-α可以減少Aβ沉積，挽救空間記憶損傷。

圖5. Pur-α減少Aβ沉積，防止AD認(rèn)知能力下降

7. CircCwc27通過(guò)與Pur-α結(jié)合調(diào)控AD基因的轉(zhuǎn)錄

對(duì)微注射LV-sh-circCon和LV-sh-circCwc27的APP/PS1小鼠海馬區(qū)進(jìn)行了RNA測(cè)序，鑒定出339個(gè)差異表達(dá)基因(圖6A)。此外，學(xué)習(xí)和記憶基因富集顯著上調(diào)(圖6B-D)。在APP/PS1小鼠和AD患者中，大部分circCwc27調(diào)控的基因表達(dá)都發(fā)生了改變(圖6E和F)。ChIP-qPCR驗(yàn)證了Pur-α直接結(jié)合到由circCwc27控制的AD異?；虻膯?dòng)子上(圖6G)。通過(guò)敲除circCwc27，Pur-α與這些基因啟動(dòng)子的結(jié)合降低被逆轉(zhuǎn)(圖6H)。總之，circCwc27通過(guò)與Pur-α結(jié)合，減少了Pur-α對(duì)AD相關(guān)基因啟動(dòng)子的招募。

圖6. CircCwc27通過(guò)與Pur-α結(jié)合調(diào)控AD基因的轉(zhuǎn)錄

結(jié)論：

總之，作者的研究結(jié)果表明，circRNA-蛋白相互作用的重要功能結(jié)果，即circCwc27通過(guò)與調(diào)控蛋白Pur-α結(jié)合，可能在AD發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并代表了一個(gè)具有臨床轉(zhuǎn)化潛力的AD治療靶點(diǎn)。