ALKBH5可能通過降低PHF20 mRNA甲基化抑制結(jié)直腸癌進(jìn)展

m6A是最廣泛的mRNA修飾，被甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基酶動(dòng)態(tài)地、可逆地調(diào)控。ALKBH5是一種主要的去甲基化酶，在癌癥的進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。然而，ALKBH5在結(jié)直腸癌(CRC)中的作用和機(jī)制尚不清楚。我們發(fā)現(xiàn)，在CRC中，ALKBH5的下調(diào)與CRC患者預(yù)后不良密切相關(guān)。在功能上，敲低ALKBH5可增強(qiáng)LOVO和RKO細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，而過表達(dá)ALKBH5可抑制這些細(xì)胞的功能。結(jié)果還表明，敲除ALKBH5可促進(jìn)LOVO在體內(nèi)的皮下腫瘤發(fā)生，而過表達(dá)ALKBH5可抑制這種能力。在機(jī)制上，MeRIP-seq和RNA-seq的聯(lián)合分析結(jié)果表明，PHF20 mRNA是一個(gè)受ALKBH5介導(dǎo)的m6A修飾調(diào)控的關(guān)鍵分子。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，ALKBH5可能通過去除PHF20 mRNA 3'UTR的m6A修飾來抑制PHF20 mRNA的穩(wěn)定性?？傊?，ALKBH5通過降低PHF20 mRNA甲基化抑制CRC進(jìn)展。ALKBH5介導(dǎo)的PHF20 mRNA的m6A修飾有望成為CRC的干預(yù)和治療策略。本文于2022年6月發(fā)布于“Clinical and Translational Medicine”（IF=8.554）上。

技術(shù)路線

結(jié)果：

1）ALKBH5在CRC中表達(dá)下調(diào)

為了評估ALKBH5在癌癥中的表達(dá)，我們初步檢測了TCGA數(shù)據(jù)集中23個(gè)實(shí)體癌癥中ALKBH5的mRNA表達(dá)。在12例實(shí)體癌中，與相鄰正常組織相比，ALKBH5明顯失調(diào)(圖1A)。與相鄰正常組織相比，ALKBH5在7種實(shí)體癌(CRC、GBM、KICH、KIRP、PRAD、THCA和UCEC)中顯著下調(diào)，在5種實(shí)體癌(CHOL、HNSC、KIRC、LIHC和LUSC)中上調(diào)。我們發(fā)現(xiàn)，與相鄰正常組織相比，TCGA-CRC隊(duì)列中腫瘤組織中的ALKBH5明顯減少。我們還從GEO數(shù)據(jù)集中下載了CRC的RNA測序數(shù)據(jù)。結(jié)果證實(shí)了CRC組織中ALKBH5 mRNA的減少(圖1 B)。RT-qPCR結(jié)果顯示，CRC組織中ALKBH5 mRNA表達(dá)明顯低于相鄰正常組織(圖1C)。我們還評估了ALKBH5蛋白在CRC中的表達(dá)。免疫組化檢測結(jié)果顯示，CRC組織中ALKBH5蛋白表達(dá)明顯降低(圖1D,E)。此外，mRNA的m6A 定量分析表明，CRC組織中mRNAs的m6A修飾水平較高(圖1F)。

2）ALKBH5缺失預(yù)示CRC患者預(yù)后較差

為了探討ALKBH5的臨床價(jià)值，我們從mRNA和蛋白水平分析了ALKBH5與CRC患者臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果表明，在mRNA水平上，下調(diào)ALKBH5與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床晚期顯著相關(guān)(圖2A, B)。一致地，在蛋白水平上，下調(diào)的ALKBH5與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床晚期顯著相關(guān)(圖2D, E)。Kaplan-Meier分析表明，缺失ALKHB5的CRC患者在mRNA(圖2C)和蛋白(圖2F)水平上的總生存期都較短。

3）敲除ALKBH5可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移

我們探索了ALKBH5對結(jié)腸癌細(xì)胞功能的影響。我們初步鑒定了五種結(jié)腸癌細(xì)胞中ALKBH5的mRNA表達(dá)，并注意到與其他結(jié)腸癌細(xì)胞系相比，LOVO和RKO細(xì)胞中ALKBH5表達(dá)升高(圖3A)。在LOVO和RKO細(xì)胞中使用三種特定的siRNA敲除ALKBH5(圖3B,C)。利用敲除效率高的兩個(gè)siRNA (siALKBH5-2, siALKBH5-3)構(gòu)建敲除質(zhì)粒(shALKBH5-2, shALKBH5-3)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。我們使用兩個(gè)獨(dú)立的ALKBH5敲除慢病毒構(gòu)建了兩個(gè)穩(wěn)定的細(xì)胞系。在mRNA和蛋白水平上驗(yàn)證敲除效率(圖3D-F)。隨后，CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，ALKBH5敲除顯著增強(qiáng)了細(xì)胞生長，以及LOVO和RKO細(xì)胞的活力(圖3G)。通過克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲除ALKBH5可顯著提高LOVO和RKO細(xì)胞的克隆形成能力(圖3H)。此外，我們使用transwell實(shí)驗(yàn)評估了LOVO和RKO細(xì)胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果表明，敲除ALKBH5可顯著提高細(xì)胞遷移和侵襲能力(圖3I,J)。為了進(jìn)一步確定ALKBH5在體內(nèi)是否影響結(jié)腸癌細(xì)胞功能，我們建立了異種移植瘤模型。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ALKBH5敲低的LOVO細(xì)胞植入時(shí)，腫瘤生長速度更快(圖4C)，腫瘤體積和重量增加(圖4A,B,D)。

4）過表達(dá)ALKBH5可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移

我們還利用慢病毒載體構(gòu)建了過表達(dá)ALKBH5的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了過表達(dá)效率(圖5A-C)。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá)ALKBH5顯著抑制細(xì)胞生長和LOVO和RKO細(xì)胞的活力(圖5D)。集落形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過表達(dá)ALKBH5導(dǎo)致LOVO和RKO細(xì)胞集落形成能力顯著降低(圖5E)。此外，通過transwell分析，過表達(dá)ALKBH5大大削弱了細(xì)胞遷移和侵襲能力(圖5F,G)。然后，我們的腫瘤異種移植模型的結(jié)果表明，當(dāng)移植過表達(dá)ALKBH5的LOVO細(xì)胞時(shí)，腫瘤生長速度較慢(圖6C)，腫瘤體積和重量降低(圖6A,B,D)。

5）ALKBH5靶向PHF20

為了鑒定m6A修飾的靶點(diǎn)，我們收集了六名CRC患者的腫瘤組織和正常組織，用于MeRIP-seq。我們通過MeRIP-seEq在六對組織中鑒定了1343個(gè)調(diào)節(jié)失調(diào)的m6A峰（圖7A）。其中，625個(gè)m6A峰在腫瘤組織中被高甲基化，而718個(gè)m6A峰在腫瘤中被低甲基化（圖7A）。接下來，625個(gè)高甲基化m6A峰分布在265個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄本中，718個(gè)低甲基化m6A峰分布在311個(gè)基因轉(zhuǎn)錄本中。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)，在MeRIP序列的六對組織中，腫瘤組織中ALKBH5的表達(dá)明顯低于正常組織中的表達(dá)（圖7B）。我們假設(shè)這265個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄由ALKBH5調(diào)控。為了進(jìn)一步探索由ALKBH5調(diào)控的m6A修飾靶點(diǎn)，我們在ALKBH55敲除的LOVO細(xì)胞和對照細(xì)胞中進(jìn)行了RNA序列分析。結(jié)果表明，ALKBH5敲除后，679個(gè)基因差異表達(dá)，包括362個(gè)上調(diào)基因和317個(gè)下調(diào)基因（圖7C，D）。結(jié)合MeRIP-seq和RNA-seq，我們發(fā)現(xiàn)19個(gè)基因通過m6A修飾潛在地受ALKBH5調(diào)控，包括11個(gè)上調(diào)基因（PCDH7、QSOX1、LAM5、CCDC69、LITAF，MDK, TGFB1I1, ATP2B4, DUSP3, PHF20和PLIN3) 和8個(gè)下調(diào)基因（NPNT、KRT20、PCSK7、SAMD4A、NEDD4L、SLC35A3、SPTLC2和DNM1L）（圖7E）。然后，我們檢測了這19個(gè)基因在ALKBH5敲除后的表達(dá)情況。RT-qPCR結(jié)果顯示，11個(gè)上調(diào)基因中，5個(gè)基因(CCDC69、LITAF、TGFB1I1、PHF20和PLIN3)在ALKBH5基因敲除的LOVO和RKO細(xì)胞中均上調(diào)(圖7F)。此外，我們發(fā)現(xiàn)，在8個(gè)下調(diào)基因中，只有PCSK7在ALKBH5敲除的LOVO和RKO細(xì)胞中下調(diào)（圖7G）。接下來，我們檢查了ALKBH5與TCGA數(shù)據(jù)庫中六個(gè)候選基因之間的相關(guān)性。我們的結(jié)果表明，在CRC中，只有PHF20與ALKBH5呈負(fù)相關(guān)（圖7H）。我們還通過Western blot檢測驗(yàn)證了與對照細(xì)胞相比，ALKBH5敲除細(xì)胞中PHF20蛋白表達(dá)的升高(圖7I)。此外，可視化分析表明，與正常組織相比，PHF20 mRNA的m6A峰在腫瘤組織中更為豐富（圖7J）。因此，PHF20可能是通過m6A修飾由ALKBH5調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子。

6）ALKBH5的缺失增加了PHF20 mRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸癌的進(jìn)展

作為去甲基酶，ALKBH5能夠從mRNA中去除m6A修飾。mRNA的m6A定量分析表明，ALKBH5缺失顯著增加了mRNA的m6A修飾水平（圖8A）。MeRIP qPCR分析表明，ALKBH5缺失顯著增加了PHF20 mRNA的m6A修飾水平（圖8B）。接下來，我們利用SRAMP數(shù)據(jù)庫和和BEMP數(shù)據(jù)庫預(yù)測PHF20 mRNA的m6A位點(diǎn)。我們發(fā)現(xiàn)PHF20 mRNA上的m6A甲基化位點(diǎn)主要位于3′UTR，并且有8個(gè)可能的m6A甲基化位點(diǎn)。根據(jù)PHF20 mRNA上的m6A甲基化位點(diǎn)，我們構(gòu)建了熒光素酶報(bào)告載體（圖8C）。熒光素酶報(bào)告分析表明，ALKBH5缺失顯著增強(qiáng)野生型PHF20 3’UTR質(zhì)粒的表達(dá)，但對具有m6A突變位點(diǎn)的PHF20 3’UTR質(zhì)粒沒有顯著影響（圖8D）。為了評估ALKBH5對PHF20 mRNA穩(wěn)定性的影響，我們用放線菌素D處理結(jié)腸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ALKBH55缺失改善了PHF20的穩(wěn)定性并延長了其半衰期（圖8E）。然后我們進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)，以確定ALKBH5是否通過調(diào)控PHF20影響結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。結(jié)果顯示，PHF20敲除抑制了shALKBH5介導(dǎo)的LOVO和RKO增殖、菌落形成、遷移和入侵的增強(qiáng)(圖8F-I)。

結(jié)論：

我們確定ALKBH5表達(dá)在CRC中下調(diào)，并起到關(guān)鍵的腫瘤抑制作用。機(jī)制上，ALKBH5通過去除m6A修飾抑制PHF20 mRNA的穩(wěn)定性。我們的研究為ALKBH5介導(dǎo)的m6A修飾的抗癌作用提供了新的見解，并表明靶向ALKBH5介導(dǎo)的PHF20 mRNA的m6A修飾可能是一種有希望的結(jié)腸癌干預(yù)和治療策略。

參考文獻(xiàn)：

Zhang Z, Wang L, Zhao L, Wang Q, Yang C, Zhang M, Wang B, Jiang K, Ye Y, Wang S, Shen Z. N6-methyladenosine demethylase ALKBH5 suppresses colorectal cancer progression potentially by decreasing PHF20 mRNA methylation. Clin Transl Med. 2022 Aug;12(8):e940. doi: 10.1002/ctm2.940.