不一樣的研究視角——乳酸受體HCAR1促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖改善新生兒腦卒中

新生兒腦缺氧缺血（HI）是新生兒死亡和殘疾的主要原因，目前唯一的治療方法是低體溫療法。然而，仍需要新的藥物來保護(hù)大腦，并在受傷后促進(jìn)其恢復(fù)。對小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，乳酸可能有助于大腦恢復(fù)。乳酸還可以作為一種信號分子，與細(xì)胞表面HCAR1結(jié)合。然而，人們對HCAR1在大腦中扮演的角色以及它是否有助于大腦從缺氧缺血性損傷中恢復(fù)知之甚少。為此，Kennedy等比較了WT和HCAR1敲除的經(jīng)歷HI腦損傷的新生小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然HCAR1并不能保護(hù)小鼠免受HI的傷害，但它確實(shí)能幫助大腦恢復(fù)，即通過啟動(dòng)與免疫系統(tǒng)和細(xì)胞周期有關(guān)的基因，導(dǎo)致新的腦細(xì)胞形成，以重新填充受傷的區(qū)域。相比之下，缺乏HCAR1的小鼠的腦組織幾乎不產(chǎn)生任何新細(xì)胞。本研究于2022年8月發(fā)表在《eLife》IF：8.713期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、HI后腦組織再生需要HCAR1

為了研究HCAR1在應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷和隨后的神經(jīng)發(fā)生中的作用，作者在9天齡的HCAR1 KO和WT小鼠中誘導(dǎo)HI。HI后，采用TTC染色檢查急性腦組織損傷，HCAR1 KO和WT小鼠在HI后24小時(shí)顯示同側(cè)半球全面損傷，兩組間的TTC百分比無顯著性差異（Figure 1A–B），表明HCAR1不能影響大腦的急性損傷。在HI急性期后，有一個(gè)神經(jīng)發(fā)生和組織修復(fù)的階段。為了評估HCAR1在組織修復(fù)中的潛在作用，測量了HI后42天的組織損失。結(jié)果顯示，WT小鼠的腦組織丟失占到17%，而HCAR1 KO小鼠的腦組織丟失高達(dá)31%，極顯著高于WT小鼠，這表明HCAR1在HI后誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生和組織修復(fù)中具有重要作用。綜上，HCAR1不能保護(hù)大腦免受腦HI后的急性組織損傷，但能促進(jìn)腦組織再生。

圖1 HCAR1不能保護(hù)大腦免受腦HI后的急性組織損傷，但能促進(jìn)腦組織再生

2、HCAR1 KO小鼠的神經(jīng)前體細(xì)胞增殖受損

缺血性損傷后的組織修復(fù)是通過增加神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖和分化來實(shí)現(xiàn)的。為了測試HCAR1對神經(jīng)前體細(xì)胞增殖和細(xì)胞命運(yùn)的影響，對來自HCAR1 KO和WT小鼠前腦的球進(jìn)行了神經(jīng)球?qū)嶒?yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)來自HCAR1 KO小鼠的神經(jīng)球與來自WT小鼠的神經(jīng)球相比發(fā)展出更少的細(xì)胞集落（Figure 2A–B and G）。兩種基因型的球體平均大小差異不顯著（Figure 2A–B and H）。這說明HCAR1 KO神經(jīng)前體細(xì)胞的自我更新能力較低，增殖能力較弱。為檢測HCAR1是否影響細(xì)胞命運(yùn)，將神經(jīng)球分離，在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天，用神經(jīng)元標(biāo)志物Tuj1和星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志物GFAP進(jìn)行免疫標(biāo)記，結(jié)果顯示與WT組比較，HCAR1 KO組Tuj1+陽性神經(jīng)元比例顯著下降（Figure 2C–D,I），而GFAP無差異（Figure 2E–F,I）。這表明HCAR1可能會(huì)引導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞走向神經(jīng)元的命運(yùn)，但還需要更多的實(shí)驗(yàn)來研究其對細(xì)胞分化的影響。

由于神經(jīng)球數(shù)據(jù)提示神經(jīng)前體細(xì)胞增殖受損，所以隨后檢測了HCAR1 KO和WT小鼠HI后的體內(nèi)細(xì)胞增殖。小鼠于HI后4-7天注射增殖標(biāo)記物BrdU，第7天處死。本文集中分析紋狀體室下生態(tài)位，因?yàn)檫@是一個(gè)包含大量缺氧缺血后細(xì)胞增殖的神經(jīng)前體細(xì)胞的區(qū)域，但由于室管膜下層區(qū)域（SVZ）的HI反應(yīng)存在區(qū)域差異，所以作者分析了兩個(gè)獨(dú)立的室下生態(tài)位區(qū)域，即心室毗鄰室下區(qū)（V-SVZ）和更側(cè)位腦室的下-中間區(qū)（SVZ-IZ）（Figure 2J）。在SVZ-IZ中，受HI影響的同側(cè)半球的總體細(xì)胞密度比WT小鼠的對側(cè)半球增加了47%，而在KO小鼠中（Figure 2K–L and O），細(xì)胞總體密度沒有影響（Figure 2M–O），并且相比于KO組，HI后WT組的總體細(xì)胞密度顯著更高（Figure 2O）。此外，WT小鼠的HI受損同側(cè)細(xì)胞增殖的BrdU +細(xì)胞比例增加了一倍，而KO小鼠無顯著改變，HI后WT組的BrdU +細(xì)胞也顯著高于KO小鼠（Figure 2P）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明HCAR1 KO小鼠在HI后不能完全激發(fā)細(xì)胞增殖。然后觀察HI誘導(dǎo)的雙皮質(zhì)素陽性（DCX+）神經(jīng)元前體細(xì)胞的增殖。HI后，在同側(cè)SVZ-IZ中兩種基因型小鼠的DCX+ / DAPI +細(xì)胞比例都增加了一倍以上，表明HCAR1 KO小鼠中有完整的反應(yīng)性神經(jīng)發(fā)生（Figure 2K–N and Q），然而DCX +BrdU +的神經(jīng)前體細(xì)胞比例的增加只在WY小鼠中觀察到，KO小鼠則沒有顯著差異（Figure 2K–N and R）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明HCAR1 KO小鼠在HI后不能增加神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖，提示HCAR1需要刺激神經(jīng)細(xì)胞增殖來誘導(dǎo)缺血損傷后的組織修復(fù)。

圖2 HCAR1調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖

3、HCAR1 KO小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞增殖和激活受損

在大腦HI之后，小膠質(zhì)細(xì)胞被招募到受傷的部位，在那里它們清除死細(xì)胞的碎片，以促進(jìn)修復(fù)過程，這過程需要增加小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、活化和遷移。與前述只有WT小鼠在HI后總細(xì)胞密度增加的腦室下生態(tài)位相反，兩種基因型小鼠梗死周圍區(qū)域的細(xì)胞密度都有增加（Figure 3A–E）。WT組HI同側(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞比例增加，HCAR1 KO組小膠質(zhì)細(xì)胞比例增加不明顯（Figure 3F）。如預(yù)期的，與對側(cè)相比，WT小鼠HI同側(cè)半球增殖的小膠質(zhì)細(xì)胞比例明顯增加，然而，在HCAR1 KO小鼠中未檢測到增加（Figure 3G）。以上HCAR1 KO導(dǎo)致表明小膠質(zhì)細(xì)胞增殖受損。

然后評估了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況。激活的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞有更大的細(xì)胞體和更少的分支，即它們有更短和更少的分支。在WT小鼠中，HI同側(cè)半球的小膠質(zhì)細(xì)胞比對側(cè)的小膠質(zhì)細(xì)胞體積更大，分支更少，這表明其表型被激活（Figure 3A–B,H-I），而在KO組則無顯著差異，表明HCAR1 KO導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞激活缺陷。

圖3 HCAR1 KO小鼠HI后小膠質(zhì)細(xì)胞活化和增殖缺陷

4、梗死區(qū)周圍的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和少突膠質(zhì)細(xì)胞增生

鑒于以上數(shù)據(jù)表明HCAR1對于HI后的神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞增殖非常重要，所以作者進(jìn)一步探究了HCAR1是否也參與了其余腦細(xì)胞如星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。用GFAP和增殖標(biāo)記物BrdU進(jìn)行免疫標(biāo)記，顯示W(wǎng)T小鼠HI同側(cè)半球的GFAP+細(xì)胞和增殖的GFAP+雖然GFAP可以標(biāo)記非反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，但需要注意的是，并非所有非反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞都是GFAP陽性，而反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征是GFAP水平高細(xì)胞的比例的顯著增加，但在HCAR1 KO小鼠中沒有增加（Figure 4A–F）。雖然GFAP可以標(biāo)記非反應(yīng)性和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，但需注意的是，并非所有非反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞都是GFAP陽性，而反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征是GFAP水平高。因此，GFAP +細(xì)胞的增加主要代表反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，這發(fā)生在梗死周圍區(qū)域。

隨后用Olig2標(biāo)記少突膠質(zhì)細(xì)胞，該標(biāo)記可以標(biāo)記所有發(fā)育階段的少突膠質(zhì)細(xì)胞。HCAR1 KO和WT小鼠HI后梗死灶周圍少突膠質(zhì)細(xì)胞或增殖少突膠質(zhì)細(xì)胞的比例均無明顯變化（Figure 4G–L）。但WT小鼠梗死區(qū)域Olig2+BrdU+標(biāo)記的增殖性少突膠質(zhì)細(xì)胞的密度顯著增加，而KO小鼠則無變化（Figure 5C-D），暗示HCAR1可能參與少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。

最后，通過使用APC標(biāo)記成熟和前少突膠質(zhì)細(xì)胞（不是少突膠質(zhì)細(xì)胞前體），發(fā)現(xiàn)HCAR1 KO和WT小鼠的中HI后同側(cè)半球的細(xì)胞比例都顯著降低了（Figure 4M–Q），APC細(xì)胞密度也都顯著下降（Figure 5E）。

以上結(jié)果表明HCAR1影響梗死區(qū)周圍的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。

圖4 HI后星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖

圖5 梗死周圍GFAP、Olig2和APC的密度測定

5、HCAR1 KO小鼠SVZ對HI的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)較弱

為研究HCAR1參與腦組織再生的機(jī)制，通過RNA測序?qū)Υ竽XHI后小鼠受影響的同側(cè)和對側(cè)（對照）半球的SVZ區(qū)域進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組分析。PCA顯示來自WT小鼠同側(cè)半球的組織樣本遠(yuǎn)離對側(cè)半球的樣本，表明對HI有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（Figure 5A）。來自HCAR1 KO小鼠對側(cè)半球的樣本與WT對側(cè)樣本具有相似的基因表達(dá)模式。值得注意的是，HI同側(cè)HCAR1 KO樣本也與WT和KO對側(cè)樣本聚在一起。表明HCAR1 KO腦室對HI的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)似乎嚴(yán)重受損。

然后，對SVZ樣本進(jìn)行GSEA分析，以識別該區(qū)域兩種基因型之間的差異調(diào)控通路。多個(gè)通路在HCAR1 KO和WT的HI同側(cè)SVZ樣本中有差異表達(dá)（Figure 5B）。有趣的是，HCAR1 KO的細(xì)胞周期通路強(qiáng)烈下調(diào)。四個(gè)不同實(shí)驗(yàn)組中差異調(diào)控細(xì)胞周期基因的相對表達(dá)情況如Figure 5C所示。與野生型相比，HCAR1 KO細(xì)胞周期基因的下調(diào)可能是HI后HCAR1 KO細(xì)胞增殖不足的原因。為在蛋白水平上驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，選擇兩個(gè)表達(dá)差異的Cyclin D2和B1進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。結(jié)果顯示，HCAR1 KO中Cyclin D2蛋白水平僅為WT的67%，B1水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Figure 5F-H）。因此，HI后HCAR1 KO細(xì)胞周期基因轉(zhuǎn)錄的降低在一定程度上可以在蛋白水平上得到證實(shí)。

與WY小鼠比較，HCAR1 KO同側(cè)半球補(bǔ)體和凝血級聯(lián)（complement and coagulation cascade）通路下調(diào)（Figure 5B and D）。有趣的是，補(bǔ)體系統(tǒng)參與了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，所以HCAR1 KO中小膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)減弱可能是上述小膠質(zhì)細(xì)胞激活下降的原因。與WT組比較，HI后HCAR1 KO中大量的小膠質(zhì)細(xì)胞激活標(biāo)記物也顯著下調(diào)（Figure 5E），這再次支持了該猜想。

總之，HCAR1 KO小鼠的SVZ區(qū)域?qū)I表現(xiàn)出強(qiáng)烈的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)受損。這可以解釋HI后細(xì)胞增殖和小膠質(zhì)細(xì)胞活化受損，提示HCAR1是缺血后組織修復(fù)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

圖5 HCAR1調(diào)控缺血的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，包括細(xì)胞周期和補(bǔ)體通路

參考文獻(xiàn)：

Kennedy Lauritz., Glesaaen Emilie R., Palibrk Vuk., Pannone Marco., Wang Wei., Al-Jabri Ali., Suganthan Rajikala., Meyer Niklas., Austb? Marie Landa., Lin Xiaolin., Bergersen Linda H., Bj?r?s Magnar., Rinholm Johanne E.(2022). Lactate receptor HCAR1 regulates neurogenesis and microglia activation after neonatal hypoxia-ischemia. Elife, 11(undefined), undefined. doi:10.7554/eLife.76451