癌癥的勁敵——BORIS在DNA損傷修復(fù)中的新角色
印跡位點(diǎn)調(diào)節(jié)劑( BORIS )的類似物在大多數(shù)癌癥中都有表達(dá)，往往與患者的短暫生存和不良預(yù)后有關(guān)。然而，其作用機(jī)制尚未闡明，也沒有已知的BORIS抑制劑。本研究堅(jiān)定了一種BORIS抑制劑，強(qiáng)調(diào)了BORIS中ADP核糖基化的重要性，揭示了BORIS在DNA損傷修復(fù)中的新功能。本研究于2022年8月發(fā)表在《Molecular Cancer》IF：41.444期刊上。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1. BORIS - binding肽的特征和選擇
BORIS-N1 - 258和BORIS-del N1 - 258通過交替洗脫來自Ph.D.?-12噬菌體展示肽庫(kù)中富集BORIS-N1 - 258結(jié)合的噬菌體克隆。BORIS-N1 – 258用來除去非特異性的噬菌體克隆，BORIS-del N1 – 258用來隨后的噬菌體克隆。經(jīng)過四輪富集，洗脫的噬菌體滴度達(dá)到一定程度。然后，用BORIS-N1-258涂層板ELISA法對(duì)這9種多肽的富集噬菌體克隆進(jìn)行檢測(cè)（圖1C）。噬菌體克隆9對(duì)BORIS-N1 - 258蛋白的結(jié)合親和力最高。
利用Fortebio Octet RED系統(tǒng)，合成多個(gè)克?。? 9和# 2）中發(fā)現(xiàn)或具有高結(jié)合親和力( # 9 )的展示肽，通過生物層干涉技術(shù)( BLI )分析其與BORIS-N1 - 258蛋白的物理相互作用。BORIS-N1 - 258蛋白與生物素結(jié)合并負(fù)載到SSA傳感器上。合成的多肽用0.02 % Tween20溶解于PBS中。肽9 （肽序列為VHWDFRQWWQPS）與BORIS-N1 - 258結(jié)合，結(jié)合親和力( Kd )為86.38 μM（圖1D）。重組肽9（肽序列為RFDHWVWQSQPW）與BORIS-N1 - 258沒有任何可測(cè)的親和力（圖1E）。肽2 ( DWSSWVYRDPQT )與BORIS-N1 - 258結(jié)合，弱結(jié)合親和力( Kd )為314.5 μM （圖1F）。為了驗(yàn)證相互作用，作者用生物素標(biāo)記多肽9，并將其負(fù)載到SA傳感器上，用一系列濃度的BORIS-N1 - 258測(cè)定Kd值，結(jié)果是5.30 nM。
BORIS-N1 - 258抗原用于選擇從該菌中純化出的肽9。為證實(shí)肽9與人細(xì)胞中BORIS-N1 - 258的相互作用，從不表達(dá)BORIS的HEK293細(xì)胞中表達(dá)并純化了BORIS-N1 - 258。與肽9對(duì)細(xì)菌表達(dá)的BORIS抗原( Kd = 5.30nM )的親和力相比，肽9與人細(xì)胞源性BORIS-N1 - 258結(jié)合，Kd值為6.37 nM（圖 1G和 1H）。
圖1 BORIS - binding肽的特征和選擇
2. 所選擇的BTApep-TAT肽與BORIS在細(xì)胞中特異性結(jié)合
合成了多肽9與HIV - 1 TAT融合肽（肽序列為 GGRKKRRQRRRG），并用生物素標(biāo)記。融合HIV- TAT肽賦予了穿透細(xì)胞膜的能力。本研究將融合HIV-1 TAT的生物素化肽9定為BTApep- TAT-biotin。合成了有生物素標(biāo)記但缺乏穿透能力的肽( BTApep-biotin )來評(píng)估穿透細(xì)胞膜的效率。用含有12個(gè)連續(xù)組氨酸與HIV-1 TAT肽融合的生物素化肽作為陰性對(duì)照肽( His – TAT – biotin )。免疫共沉淀法檢測(cè)BTApep - TAT - biotin與BORIS的相互作用。BTApep- TAT-biotin與全長(zhǎng)BORIS和BORIS-N1 - 258結(jié)合，而不能與BORIS-delN1 - 258結(jié)合（圖2A）。用siRNA ( siBORIS _ 1 )敲除H1299細(xì)胞中的BORIS后，商業(yè)BORIS抗體與BTApep- TAT-biotin肽的結(jié)合能力降低，表明BTApep-TAT能夠特異性結(jié)合細(xì)胞中的BORIS（圖2B）。
圖2 所選擇的BTApep - TAT肽與BORIS在細(xì)胞中特異性結(jié)合，誘導(dǎo)癌細(xì)胞DNA損傷和凋亡
3. BTApep - TAT誘導(dǎo)癌細(xì)胞DNA損傷和凋亡
采用BTApep - TAT梯度稀釋法處理H1299肺癌細(xì)胞，進(jìn)行MTT檢測(cè)和細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BTApep- TAT在25 ~ 100 μM濃度下處理3天后，H1299細(xì)胞的增殖受到抑制（圖2C）。此外，BTApep- TAT抑制H1299細(xì)胞的增殖，而非正常HEK293細(xì)胞，BORIS不表達(dá)。BTApep不穿透細(xì)胞膜，不抑制細(xì)胞增殖（圖2D）。
為探討B(tài)TApep - TAT對(duì)BORIS的靶向性，采用高通量RNA測(cè)序方法比較了BTApep - TAT處理H1299細(xì)胞和2個(gè)siRNA敲除BORIS后的轉(zhuǎn)錄組細(xì)胞。BTApep - TAT處理和BORIS敲除樣本間基因表達(dá)譜的熱圖比較如圖2E所示。KEGG通路分析顯示了與1004個(gè)共同基因相關(guān)的頂端通路（圖2F）。在H1299細(xì)胞中，caspase-3/7實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BTApep-TAT誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BTApep-TAT引起DNA損傷（圖2G和2H）。因此，BTApep- TAT處理可能會(huì)減弱BORIS對(duì)癌細(xì)胞基因組穩(wěn)定性的保護(hù)作用。
4. BTApep - TAT抑制癌細(xì)胞中BORIS調(diào)控的DNA損傷修復(fù)
環(huán)境和內(nèi)部應(yīng)力，如誘變性化學(xué)物質(zhì)、電離輻射( IR )、活性氧( ROS )和mis-replication 壓力，誘發(fā)DNA損傷，包括DNA單鏈斷裂( SSBs )和雙鏈斷裂( DSBs )。DNA修復(fù)受損會(huì)積累DNA病變，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定。DNA修復(fù)異常促進(jìn)癌癥進(jìn)展。即：BTApep - TAT誘導(dǎo)DNA損傷，減弱了BORIS對(duì)癌細(xì)胞基因組的保護(hù)作用。本研究將轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)BORIS或BORIS-N1 - 258的HeLa細(xì)胞的粗核提取物與含有DNA損傷的模板和對(duì)照模板的混合物進(jìn)行無細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。BORIS-N1 - 258與BORIS相同程度地增強(qiáng)了SSBR活性（圖3A），表明BORIS的AA1 - 258N末端負(fù)責(zé)BORIS的SSBR活性。接下來，在表達(dá)BORIS的HeLa細(xì)胞的粗核提取物中加入BTApep - TAT或His - TAT （陰性對(duì)照肽）。BTApep- TAT顯著抑制SSBR和BER，而不抑制His- TAT（圖 3B和 3C）。這些結(jié)果也表明BTApep- TAT而不是His- TAT誘導(dǎo)癌細(xì)胞DNA損傷和凋亡（圖 2G和 2H）。
作者采用基于XhoⅠ線性化質(zhì)粒的體外DNA末端連接實(shí)驗(yàn)評(píng)估了BORIS和BTApep- TAT在NHEJ中的功能。相關(guān)數(shù)據(jù)表明，BORIS促進(jìn)了高效的末端加入。BTApep- TAT，而非His- TAT，處理抑制了約30 % BORIS誘導(dǎo)的末端連接（圖3D）。BORIS-RFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行DNA損傷修復(fù)的細(xì)胞百分比的比較如圖3E所示。流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和分析。總的來說，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BORIS促進(jìn)了癌細(xì)胞中SSB和DSB的修復(fù)，BTApep- TAT抑制了由BORIS控制的DNA損傷修復(fù)。
圖3 BTApep - TAT抑制癌細(xì)胞中BORIS調(diào)控的DNA損傷修復(fù)
5. BTApep - TAT抑制BORIS的ADP核糖化來應(yīng)對(duì)DNA損傷
HeLa和H1299細(xì)胞轉(zhuǎn)染C端Myc-tagged BORIS。用抗ADP-核糖抗體免疫沉淀（同時(shí)識(shí)別多聚和單聚ADP-核糖基化）表明BORIS-myc被ADP-核糖修飾（圖4A）。我們利用純化的BORIS - N1 - 258蛋白和生物素標(biāo)記的PAR聚合物進(jìn)行了體外ADP核糖基化實(shí)驗(yàn)，證實(shí)BORIS的ADP核糖基化作用。生物素標(biāo)記的PAR與BORIS - N1 - 258在體外呈濃度依賴性結(jié)合（圖4B）。然后用抗ADP核糖抗體對(duì)轉(zhuǎn)染BORIS-N1 - 258 - myc的H1299細(xì)胞進(jìn)行免疫沉淀，證實(shí)了BORIS-N1 - 258 - myc的修飾作用。BORIS-N1 - 258 - myc的ADP核糖基化水平與全長(zhǎng)BORIS ( BORIS-myc )相當(dāng)（圖4C）。這些結(jié)果證明了BORIS在氨基酸1 ~ 258中ADP核糖基化。
其次，研究了DNA損傷條件下BORIS的ADP核糖基化水平。合成雙鏈DNA ( dsDNA )用于模擬DNA損傷細(xì)胞中的DNA斷裂。將合成的dsDNA加入到BORIS表達(dá)細(xì)胞的裂解液中，檢測(cè)其ADP核糖基化水平，發(fā)現(xiàn)dsDNA能促進(jìn)BORIS在HeLa和H1299細(xì)胞中的ADP核糖基化（圖4D）。此外，IR（照射）輕微誘導(dǎo)BORIS的ADP核糖基化（圖4E），H2O2誘導(dǎo)BORIS的ADP核糖基化相當(dāng)大（圖4F）。X射線照射產(chǎn)生的SSB比DSB多25倍。這些結(jié)果提示dsDNA或ssDNA誘導(dǎo)BORIS發(fā)生ADP-核糖基化的幅度存在差異。雖然ssDNA和dsDNA均促進(jìn)了BORIS的ADP核糖基化，但dsDNA的誘導(dǎo)作用強(qiáng)于ssDNA （圖4G）。
將純化的BORIS-N1 - 258蛋白分別與25 μM和50 μM的BTApep- TAT或His- TAT預(yù)孵育后進(jìn)行體外ADP核糖基化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)BTApep- TAT能有效抑制BORIS-N1 - 258的ADP核糖基化（圖4H）。轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞的BORIS-myc的修飾也被25 μM BTApep- TAT處理而不被His- TAT處理所抑制（圖4I）。這些結(jié)果表明，BTApep- TAT無論在體外還是在體內(nèi)都明顯抑制了BORIS的ADP核糖基化。
圖4 BTApep - TAT抑制BORIS的ADP核糖化來應(yīng)對(duì)DNA損傷
6. BTApep - TAT抑制BORIS 第198 - 228位的ADP核糖基化，阻斷了BORIS與Ku70的相互作用
假設(shè)BORIS-N1 - 258的功能需要ADP核糖基化，為了確定BORIS中ADP核糖基化的位點(diǎn)，作者制作了幾個(gè)截?cái)嗤蛔凅w。缺失AA2 - 227產(chǎn)生了與AA228 - 663相對(duì)應(yīng)的截短BORIS蛋白，與缺失AA2 - 197產(chǎn)生的AA 198 - 663 BORIS相比，該截短產(chǎn)物ADP核糖基化明顯減少。這一觀察表明，改性的主要位點(diǎn)位于殘留物198 – 228（圖 5A和 B）之間。已知谷氨酸近端序列為ADP核糖基化。利用ADPredict軟件進(jìn)行區(qū)域和站點(diǎn)的預(yù)測(cè)BORIS的N個(gè)區(qū)域，谷氨酸殘基198、204、214、225和226是推測(cè)的ADP核糖基化位點(diǎn)，在小鼠、大鼠和人類中進(jìn)化保守（圖5B）。因此，將該區(qū)域內(nèi)的5個(gè)谷氨酸( E )殘基全部替換為丙氨酸殘基( A )，產(chǎn)生了BORIS的五元組突變體( 5EA )（圖5B）。5EA突變降低了BORIS的ADP核糖基化（圖5C）。雖然5EA突變并未完全取消BORIS的ADP核糖基化，但觀察到明顯下降。BORISN1 - 258內(nèi)另外兩個(gè)潛在的ADP-核糖基化區(qū)( AA 29 - 33和 AA 165 - 185 )也通過丙氨酸殘基替換谷氨酸殘基而發(fā)生突變；然而，這些突變并沒有減弱ADP核糖基化（圖5D）。如圖5C和D所示，5EA突變體降低了表觀分子量，而E29 - 33A或E165 - 185突變體降低不明顯。
BORIS-N198 - 228肽的多聚ADP核糖基化與其豐度成比例累積（圖5E）。BORIS-5EA在體內(nèi)照射或體外DNA連接實(shí)驗(yàn)中對(duì)DNA修復(fù)無活性（圖5F-G）。當(dāng)細(xì)胞與BTApep- TAT孵育后，BORIS與Ku70的相互作用被阻斷（圖5H）。BORIS - 5EA僅與Ku70弱相互作用，表明BORIS與Ku70結(jié)合需要ADP核糖基化（圖5I）。綜上所述，BORIS的ADP核糖基化與Ku70和DNA修復(fù)有關(guān)。BTApep- TAT通過干擾BORIS的ADP核糖基化及隨后與Ku70的相互作用，減弱了BORIS在DNA損傷修復(fù)中的功能。
圖5 BTApep - TAT抑制BORIS 198 - 228位點(diǎn)的ADP核糖基化，阻斷了BORIS與Ku70的相互作用
7. BTApep - TAT可抑制皮下腫瘤的進(jìn)展
為了驗(yàn)證BTApep - TAT在體內(nèi)的功能，本研究利用體外對(duì)BTApep - TAT敏感的H1299細(xì)胞，建立NOD / SCID / γ c null ( NSG )小鼠移植瘤模型。12只小鼠前肢皮下注射H1299細(xì)胞（1×106/只）。1周后，將小鼠分為2組（每組6只），隔天腹腔注射16mg / kg BTApep- TAT或His- TAT，連續(xù)3周。隔日對(duì)腫瘤進(jìn)行評(píng)估。安樂死和腫瘤切除后，于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)量腫瘤重量（圖6A）。與His- TAT治療相比，BTApep- TAT抑制腫瘤生長(zhǎng)（圖6B）。此外，BTApep - TAT處理未引起肝、腎毒性（圖6C）。腫瘤切片檢查采用TUNEL法。用BTApep- TAT治療3周，而不用His- TAT，誘導(dǎo)皮下腫瘤細(xì)胞DNA損傷（圖6D）。
圖6 BTApep - TAT可抑制皮下腫瘤的進(jìn)展
結(jié)論
本研究表明BTApep- TAT肽可以靶向BORIS。BTApep - TAT與BORIS相互作用，抑制BORIS相關(guān)轉(zhuǎn)錄組，模擬BORIS敲減的效應(yīng)。BTApep- TAT抑制癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，抑制移植瘤模型中NSCLC進(jìn)展，抑制BORIS的ADP核糖基化。BORIS在198 - 228殘基上的ADP核糖基化促進(jìn)了與Ku70的相互作用，并負(fù)責(zé)DNA修復(fù)。研究結(jié)果表明了BTApep- TAT肽用于癌癥治療的可行性，為今后深入剖析BORIS的調(diào)控機(jī)制和設(shè)計(jì)優(yōu)化的BORIS抑制劑提供了依據(jù)。
參考文獻(xiàn)
Zhang Y, Fang M, Li S, Xu H, Ren J, Tu L, Zuo B, Yao W, Liang G.(2022) BTApep-TAT peptide inhibits ADP-ribosylation of BORIS to induce DNA damage in cancer. Mol Cancer. 21(1):158. doi: 10.1186/s12943-022-01621-w.