新發(fā)現(xiàn)——鐵死亡促進(jìn)椎間盤退化癥

鐵離子過載是老年群體中普遍現(xiàn)象。大量臨床研究表明鐵過載與椎間盤退化（IVDD）的發(fā)生率和病理進(jìn)展之間的有關(guān)聯(lián)。然而，鐵參與IVDD進(jìn)展的作用和潛在機(jī)制此前未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)鐵超載促進(jìn)終板退變和鈣化，從而導(dǎo)致IVDD進(jìn)展，且這與氧化應(yīng)激和鐵死亡通路有關(guān)。本研究于2022年8月發(fā)表在《Free Radical Biology and Medicine》IF:8.101期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、鐵超載是IVDD的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子

本研究將腰椎間盤突出癥（LDH）患者分為嚴(yán)重椎間盤退化組（Pfirrmann grade IV or V）和不嚴(yán)重椎間盤退化組（Pfirrmann grade I II or III），如表2所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重椎間盤退化組患者血清鐵蛋白的水平在顯著高于不嚴(yán)重組（圖1A）。隨后評估鐵過載和軟骨終板骨軟骨炎的關(guān)系，將患者依據(jù)modic分為2組。結(jié)果顯示與non-modic組比較，modic組患者的血清鐵蛋白的水平顯著升高（圖1B）。

圖1鐵離子過載是IVDD的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子

2、鐵超載加速IVDD的發(fā)生，促進(jìn)軟骨終板鈣化

之后通過建立小鼠鐵超載模型，評估鐵超載對椎間盤的直接影響。將小鼠隨機(jī)分為3組，對照組，低劑量鐵給藥組，和高劑量鐵給藥組。HE染色結(jié)果顯示高劑量鐵給藥組小鼠松質(zhì)骨和終板組織可見大量鐵沉積，此外，與對照組相比，低鐵劑量組小鼠體內(nèi)還觀察到了鐵沉積（圖2A-2B）。對照組的椎間盤顯示正常，表現(xiàn)為髓核含有豐富的脊索細(xì)胞，周圍有大面積的細(xì)胞外基質(zhì)，軟骨終板由軟骨細(xì)胞組成的透明軟骨組成。鐵過載組椎間盤出現(xiàn)退行性改變，其髓核變小，軟骨終板深部可見含骨髓和礦化骨的骨組織。鐵過載組的椎間盤組織學(xué)評分也顯著高于對照組（圖2D）。為進(jìn)一步評估鐵過載對軟骨退化和鈣化的影響，進(jìn)行了micro-CT（圖2C），三維骨結(jié)構(gòu)定量顯示鐵超載組BV/TV較對照組明顯升高，與對照組相比，鐵超載組椎間盤高度降低（圖2E-2F）。這些結(jié)果表明，在小鼠模型中過量的鐵加速了軟骨終板的退變，并以劑量依賴的方式加速了IVDD的進(jìn)展。

圖2鐵超載加速IVDD的發(fā)生，促進(jìn)軟骨終板鈣化

3、鐵超載促進(jìn)終板軟骨細(xì)胞礦化

IVDD是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，包括纖維環(huán)和終板的退化，以及髓核的脫水和收縮。最近的研究表明，軟骨終板退化和鈣化是IVDD發(fā)生的初始和主要誘因。為進(jìn)一步研究鐵超載對終板退變和鈣化的影響，采用免疫組化染色檢測軟骨細(xì)胞退化標(biāo)志物COL10和OCN的表達(dá)水平。如圖3A-3D所示，與對照組相比，鐵超載組終板軟骨細(xì)胞COL10和OCN陽性的比例更高。有趣的是，與低劑量鐵組相比，高劑量鐵組的COL10和OCN陽性細(xì)胞的百分比較低，盡管高劑量鐵組存在含有骨髓和骨礦化的組織。

此前有報(bào)道稱，鐵對成骨有正、負(fù)兩方面的作用，其作用取決于鐵的濃度。為探討過量鐵對終板軟骨細(xì)胞礦化的影響，分離終板軟骨細(xì)胞，在添加不同濃度檸檬酸鐵銨（FAC）的成骨分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天。如圖3E-H所示，10 μM FAC處理可導(dǎo)致終板軟骨細(xì)胞鈣沉積和ALP活性，而25 μM FAC對鈣沉積和ALP活性均有抑制作用。在WB中也觀察到類似的趨勢，F(xiàn)AC處理后COL10和runx2蛋白表達(dá)增加，且呈劑量依賴性。此外，中度FAC處理顯著促進(jìn)終板軟骨細(xì)胞COL10和RUNX2蛋白表達(dá)，而100 μM以上的FAC顯著抑制成骨分化標(biāo)志物RUNX2的表達(dá)（Fig. 3I-J）。

圖3過量的鐵促進(jìn)終板軟骨細(xì)胞的成骨分化和礦化

4、鐵超載促進(jìn)基質(zhì)降解酶的表達(dá)，加速終板軟骨細(xì)胞的退化

為了評估過量鐵對終板軟骨細(xì)胞的不利影響，軟骨細(xì)胞用不同濃度的FAC處理24小時(shí)。如圖4A所示，F(xiàn)AC處理降低II型膠原酶（COL2）的合成。同時(shí)WB顯示FAC處理呈劑量依賴的方式促進(jìn)MMP3和MMP13的表達(dá)，降低COL2的表達(dá)（圖4B-C）。隨后引入鐵螯合劑DFO進(jìn)一步驗(yàn)證鐵過載的影響，結(jié)果顯示DFO顯著逆轉(zhuǎn)FAC對軟骨細(xì)胞的不利影響（圖4D-G）。同時(shí)，DFO處理后SOX9和COL2表達(dá)水平上調(diào)，逆轉(zhuǎn)了鐵超載的影響。類似的結(jié)果在體內(nèi)也被觀察到，IHC顯示鐵超載抑制終板軟骨細(xì)胞中COL2的表達(dá)并促進(jìn)MMP3和MMP13的表達(dá)（圖4H）。

圖4鐵超載加速軟骨終板退化

5、鐵超載介導(dǎo)的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞退化和礦化

為研究鐵超載促進(jìn)終板軟骨細(xì)胞退化的潛在機(jī)制，軟骨細(xì)胞與濃度增加的FAC孵育24小時(shí)，并使用DCFH-DA探針評估ROS的產(chǎn)生。免疫熒光和流式分析結(jié)果顯示FAC以劑量依賴的方式促進(jìn)ROS的產(chǎn)生（圖5A-C）。據(jù)報(bào)道氧化應(yīng)激在終板礦化和退化中起作用。過量的鐵通過芬頓反應(yīng)催化產(chǎn)生劇毒的羥基自由基。因此，進(jìn)一步研究過量鐵誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是否介導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞退化和礦化。為此，用100 μM的FAC和100 μM的抗氧化劑NAC處理原代軟骨細(xì)胞。如圖5D-G所示，100 μM FAC能顯著促進(jìn)MMP3和MMP13的表達(dá)，抑制SOX9和COL2的表達(dá)，NAC共處理顯著逆轉(zhuǎn)了鐵超載對終板軟骨細(xì)胞的有害影響。此外，NAC顯著抑制FAC誘導(dǎo)的肥厚和成骨標(biāo)志物COL10和RUNX2的表達(dá)（圖5H-I）。這些結(jié)果表明，氧化應(yīng)激在鐵超載誘導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞退化和礦化過程中起重要作用。

圖5鐵超載介導(dǎo)的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞退化和礦化

6、鐵超載促進(jìn)終板軟骨細(xì)胞線粒體功能障礙和鐵死亡

隨后研究鐵超載誘導(dǎo)的終板軟骨細(xì)胞鐵死亡是否參與了終板軟骨細(xì)胞退化。WB顯示GPX4和SLC7A11的表達(dá)隨著FAC濃度的增加而逐漸減少，GPX4的免疫熒光染色支持了該結(jié)果，即FAC處理抑制鐵死亡相關(guān)蛋白GPX4和SLC7A11的表達(dá)（圖6A-C）。在小鼠鐵超載模型中，也觀察到GPX4表達(dá)以FAC劑量依賴的方式下降（圖6E-F）。這些結(jié)果表明鐵超載通過抑制GPX4和促進(jìn)脂質(zhì)過氧化（4HNE）促進(jìn)體內(nèi)終板軟骨細(xì)胞鐵死亡。此外，免疫熒光觀察到健康軟骨細(xì)胞的線粒體呈細(xì)長的線狀，而經(jīng)FAC處理后，縮短的線粒體數(shù)量顯著增加（圖6D）。鐵螯合劑DFO可以挽救鐵超載引起的GPX4和SLC7A11蛋白表達(dá)下降（圖6I-J）。

圖6鐵超載促進(jìn)終板軟骨細(xì)胞線粒體功能障礙和鐵死亡

7、鐵死亡在終板軟骨細(xì)胞退化中起重要作用

為進(jìn)一步闡明鐵死亡在鐵超載誘導(dǎo)的終板軟骨細(xì)胞退化中的作用，引入鐵死亡抑制劑Fer-1。結(jié)果如圖7所示，F(xiàn)er-1共處理能顯著逆轉(zhuǎn)FAC誘導(dǎo)引起的COL2表達(dá)抑制、細(xì)胞凋亡、GPX4和SLC7A11表達(dá)下降、MMP3和MMP13表達(dá)升高。這些結(jié)果表明鐵死亡參與終板軟骨細(xì)胞退化。

圖7鐵死亡抑制劑Fer-1拯救鐵超載誘導(dǎo)的終板軟骨細(xì)胞變性

8、鐵螯合、抗氧化劑和鐵死亡抑制可減輕鐵超載引起的椎間盤退化

進(jìn)一步研究鐵螯合劑DFO、抗氧化劑NAC和鐵死亡抑制劑Fer-1是否能在小鼠體內(nèi)抑制鐵超載誘導(dǎo)的椎間盤退變。如圖8A和8D所示，DFO、NAC和Fer-1處理顯著抑制了鐵超載誘導(dǎo)的IVDD。micro-CT分析顯示DFO、NAC和Fer-1處理可以顯著抑制鐵超載誘導(dǎo)的終板鈣化和椎間盤塌陷（圖8B, E-F），也可以逆轉(zhuǎn)鐵超載引起的COL2，MMP3和MMP13表達(dá)改變（圖8C, G-I）。這些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)了氧化應(yīng)激和鐵死亡在鐵超載誘導(dǎo)的椎間盤退化中發(fā)揮重要作用。

圖8鐵螯合、抗氧化劑和鐵死亡抑制可減輕鐵超載引起的椎間盤退化

本研究首次證明了鐵超載是IVDD進(jìn)展的危險(xiǎn)因素。作者提出，由鐵超載觸發(fā)的氧化應(yīng)激和鐵死亡可以促進(jìn)軟骨終板退化和鈣化，從而導(dǎo)致IVDD的進(jìn)展。降低鐵含量、抑制氧化應(yīng)激和抑制鐵死亡是鐵超載誘導(dǎo)IVDD的有效治療機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

Wang Wenchao., Jing Xingzhi., Du Ting., Ren Jiabin., Liu Xiaoyang., Chen Feifei., Shao Yuandong., Sun Shengyao., Yang Guihe., Cui Xingang.(2022). Iron overload promotes intervertebral disc degeneration via inducing oxidative stress and ferroptosis in endplate chondrocytes. Free Radic Biol Med, 190(undefined), 234-246. doi:10.1016/j.freeradbiomed.2022.08.018