癌癥治療福音——41.444分的m6A修飾circRNA靶點(diǎn)

Circular RNA ( circRNAs )是一類缺乏5′cap結(jié)構(gòu)和poly ( A )尾的閉環(huán)非編碼RNA。N6-甲基腺苷（m6A）修飾可增強(qiáng)結(jié)合mRNA/long noncoding RNAs（lncRNAs）轉(zhuǎn)化為microRNAs（miRNAs）的能力。結(jié)直腸癌（colorectal cancer , CRC）是中國(guó)女性癌癥死亡的第二大原因，死亡人數(shù)僅次于肺癌，但是機(jī)制尚不清楚。本研究的目的是研究circALG1是否能夠成為CRC的潛在治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志。結(jié)果證實(shí)：m6A修飾可增強(qiáng)circALG1與miR-342-5p的結(jié)合能力，促進(jìn)circALG1的ceRNA功能，circALG1可能成為CRC的潛在治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志。本研究于2022年3月發(fā)表在《Molecular Cancer》IF：41.444期刊上。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、  circALG1在CRC中高表達(dá)

circRNA的芯片分析結(jié)果顯示，353個(gè)circRNAs在CRC患者癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織（圖1A），54個(gè)circRNAs在CRC患者外周血中的表達(dá)水平高于健康人（圖1B）。通過(guò)分析circRNAs在結(jié)直腸癌組織和外周血中的高表達(dá)，研究鑒定了2個(gè)circRNA，即circALG1和circCOL6A3 （圖1C）。然后使用在線網(wǎng)站SRAMP ( http://www.cuilab.cn/sramp)發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)circRNAs都可以經(jīng)歷這種修飾。由于circALG1在CRC患者的組織和外周血中的整體表達(dá)水平高于circCOL6A3，所以，選擇了circALG1作為后續(xù)研究的重點(diǎn)。此外，作者利用基因表達(dá)譜（Gene Expression Omnibus，GEO）中的GSE126094數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在CRC癌組織中circALG1的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織（圖1D）。從CRC患者、術(shù)前及術(shù)后收集40對(duì)癌組織及癌旁組織，20例CRC患者術(shù)后1周血標(biāo)本，15例健康人外周血標(biāo)本進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，circALG1在CRC患者的癌組織（圖1E）和外周血（圖1F）中均高表達(dá)。更有趣的是，CRC患者術(shù)后1周外周血中circALG1的表達(dá)水平顯著降低（圖1G）。受試者工作特征曲線（ROC）分析顯示，circALG1在CRC患者癌組織及癌旁組織（圖1H）、CRC患者及健康體檢者外周血（圖1I）、CRC患者術(shù)前及術(shù)后外周血（圖1J）中的表達(dá)水平均有較好的區(qū)分。

圖1 circRNA表達(dá)譜分析顯示，circALG1在CRC中高表達(dá)。

2、  CRC細(xì)胞中circALG1的特征

針對(duì)circALG1的成環(huán)位點(diǎn)設(shè)計(jì)了聚合引物和發(fā)散引物。瓊脂糖凝膠電泳顯示，聚合引物在cDNA和gDNA中均擴(kuò)增出條帶，而發(fā)散引物只在cDNA中擴(kuò)增出條帶。進(jìn)一步的cDNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)有成環(huán)存在（圖2A），表明circALG1具有循環(huán)性。與親本基因ALG1 mRNA相比，circALG1對(duì)RNase R消化表現(xiàn)出抵抗性（圖2B）。經(jīng)放線菌素處理后，circALG1在細(xì)胞中的降解速率明顯慢于ALG1 mRNA （圖2C），說(shuō)明circALG1是穩(wěn)定的。核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)顯示，circALG1主要定位于細(xì)胞質(zhì)（圖2D）。同樣的結(jié)果也來(lái)自于circALG1 FISH （圖2E）。

圖2 CRC細(xì)胞中circALG1的特性。

3、  circALG1在體外和體內(nèi)均可促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移

研究檢測(cè)了circALG1在5種細(xì)胞系（FHC、HT29、HCT116、SW480和SW620）中的表達(dá)水平。與FHC細(xì)胞相比，circALG1在HT29和HCT116細(xì)胞中表達(dá)較低，在SW480和SW620細(xì)胞中表達(dá)較高。選取circALG1表達(dá)量最低的HCT116細(xì)胞和circALG1表達(dá)量最高的SW480細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。研究構(gòu)建了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)circALG1的HCT116細(xì)胞，其過(guò)表達(dá)效率見(jiàn)。作者設(shè)計(jì)了3個(gè)針對(duì)circALG1干擾的siRNA，敲低效率見(jiàn)。利用si-3序列構(gòu)建干擾circALG1表達(dá)的慢病毒，并構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)circALG1后HCT116細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)（圖3A），沉默circALG1后SW480細(xì)胞的遷移和侵襲能力減弱（圖3B）。

然后，檢測(cè)親本線性ALG1是否會(huì)影響circALG1的功能，q RT-PCR結(jié)果顯示，circALG1的過(guò)表達(dá)和干擾對(duì)線性ALG1 m RNA的表達(dá)沒(méi)有影響。還構(gòu)建了ALG1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染HCT116和SW480細(xì)胞。作者設(shè)計(jì)了3個(gè)針對(duì)ALG1干擾的siRNA，其敲除效率如附圖2B所示。在HCT116裸鼠轉(zhuǎn)移瘤模型中，circALG1過(guò)表達(dá)組肝、肺轉(zhuǎn)移數(shù)目較高（圖3C）；在SW480裸鼠轉(zhuǎn)移瘤模型中，干擾circALG1的表達(dá)減少了肝、肺轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量（圖3D）。這些結(jié)果表明，circALG1與CRC轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

圖3 circALG1在體內(nèi)促進(jìn)CRC轉(zhuǎn)移。

4、  m6A修飾后的circALG1增強(qiáng)了CRC的遷移和侵襲能力

使用在線網(wǎng)站SRAMP，發(fā)現(xiàn)circALG1極有可能進(jìn)行m6A修改；此外，在甲基化RNA免疫沉淀( MeRIP )實(shí)驗(yàn)中還觀察到了circALG1的富集，證實(shí)了circALG1確實(shí)發(fā)生了m6A修飾（圖4A）。作者研究了circALG1的m6A修飾水平對(duì)circALG1功能的影響：將circALG1中2個(gè)可能的m6A修飾位點(diǎn)突變后，構(gòu)建野生型和突變型質(zhì)粒（圖4B）。用等量的野生型和突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染circALG1穩(wěn)定沉默的SW480細(xì)胞株。qRT-PCR分析顯示，不同組別之間的circALG1表達(dá)水平無(wú)差異（圖4C）；突變1個(gè)位點(diǎn)后，m6A修飾的circALG1細(xì)胞內(nèi)水平降低，而突變2個(gè)位點(diǎn)后，細(xì)胞內(nèi)均未見(jiàn)m6A修飾的circALG1（圖4D）。功能實(shí)驗(yàn)表明，circALG1突變減少了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲（圖4E）。這些結(jié)果表明，circALG1 m6A修飾水平與CRC細(xì)胞的遷移和侵襲能力呈正相關(guān)。

圖4 m6A修飾的circALG1促進(jìn)SW480細(xì)胞的CRC轉(zhuǎn)移。

5、  circALG1通過(guò)作為miR?342?5p海綿促進(jìn)CRC細(xì)胞的遷移和侵襲

circRNA通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮作用。最常見(jiàn)的機(jī)制是ceRNA；即通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，解除miRNA對(duì)靶基因mRNAs的抑制作用，這一過(guò)程在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行。之前的研究顯示，circALG1主要定位于胞漿內(nèi)，表明circALG1可能通過(guò)ce RNA介導(dǎo)CRC轉(zhuǎn)移。作者使用Arraystar miRNA靶預(yù)測(cè)軟件( Arraystar，Rockville，MD，USA )對(duì)miRNA應(yīng)答元件( MREs )進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到5個(gè)最可能與circ ALG1結(jié)合的miRNA：miR-302d-3p、miR-342-5p、miR-372-3p、miR-483-5p和miR-520d-3p。

為了研究這5個(gè)miRNA與circALG1的相互作用，進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建含有circALG1野生型序列的SV40-firefly_Luciferase-MCS質(zhì)粒，與miRNA模擬物和Renilla熒光素酶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。miR-342-5p組熒光活性減弱（圖5A），提示miR-342-5p可能與circALG1結(jié)合。然后檢測(cè)miR-342-5p在CRC組織中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-342-5p在CRC組織中低表達(dá)。根據(jù)預(yù)測(cè)的circALG1與miR-342-5p的結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了含有circALG1突變序列（圖5B左）的SV40 -螢火蟲_熒光素酶MCS質(zhì)粒。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染含有circALG1野生型序列的螢火蟲熒光素酶質(zhì)粒后，miR-342-5p模擬物顯著降低了熒光強(qiáng)度，而miR-342-5p抑制劑增強(qiáng)了熒光強(qiáng)度。與含有circALG1突變序列的質(zhì)粒( 圖 5B，右)相比，miR-342-5p與circALG1特異性結(jié)合。

在circALG1的RAP檢測(cè)中，作者也觀察到miR-342-5p富集（圖5C）。功能實(shí)驗(yàn)顯示，在HCT116細(xì)胞中，miR-342-5p過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了circALG1過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的遷移侵襲能力增強(qiáng)（圖5D），而在SW480細(xì)胞中，miR-342-5p抑制逆轉(zhuǎn)了circALG1沉默誘導(dǎo)的遷移侵襲能力降低（圖5E）。這些說(shuō)明circALG1通過(guò)海綿吸附miR-342-5p促進(jìn)CRC細(xì)胞的侵襲和遷移。

圖5 circALG1通過(guò)miR-342-5p促進(jìn)CRC的遷移和侵襲。

6、  PGF是circALG1/miR?342?5p信號(hào)軸的下游靶點(diǎn)

為了確定circALG1 / miR-342-5p信號(hào)軸的下游靶基因，作者從circALG1沉默前后的SW480細(xì)胞中提取RNA進(jìn)行RNA測(cè)序。共獲得76個(gè)表達(dá)量> 2倍上調(diào)的基因。對(duì)這76個(gè)基因的GO分析也顯示它們富集在與轉(zhuǎn)移相關(guān)的通路中。根據(jù)TargetScan網(wǎng)站和RNA測(cè)序預(yù)測(cè)，共有7個(gè)基因被鑒定為miR-342 - 5p下游靶基因(圖6A )。通過(guò)檢索生物信息學(xué)網(wǎng)站UALCAN ( http://ualcan. path.uab.edu / )，作者發(fā)現(xiàn)只有PGF在CRC中高表達(dá)，提示預(yù)后不良（圖6B-C，PGF在本研究收集的CRC標(biāo)本中也高表達(dá)）。

相關(guān)性分析顯示，CRC組織中PGF的表達(dá)水平與miR-342-5p( R=-0.547 , p < 0.001 )呈負(fù)相關(guān)（圖6E）。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染含有PGF3’UTR野生型序列的螢火蟲熒光素酶質(zhì)粒后，miR-342-5p模擬物降低了熒光素酶活性，而miR-342-5p抑制劑提高了熒光素酶活性。轉(zhuǎn)染含有PGF3′UTR突變序列的螢火蟲熒光素酶質(zhì)粒后未觀察到類似現(xiàn)象，說(shuō)明miR-342 - 5p能特異性結(jié)合PGF3′UTR，抑制其表達(dá)（圖6F）。在本研究中，PGF過(guò)表達(dá)顯著上調(diào)CRC細(xì)胞中ERK的磷酸化水平，降低和增加上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化( epithelial-mesenchymal transition，EMT )相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin和vimentin的表達(dá)；PGF沉默后觀察到相反的結(jié)果（圖6I）。因此，PGF通過(guò)調(diào)控EMT影響CRC轉(zhuǎn)移。

在CRC標(biāo)本中，作者也觀察到PGF高表達(dá)，p-ERK水平和vimentin表達(dá)增加，E-cadherin表達(dá)降低（圖6L）。綜上所述，PGF是circALG1/ miR-342-5p信號(hào)軸的下游靶基因。

圖6 PGF是circALG1/ miR-342-5p信號(hào)軸的下游靶點(diǎn)。

7、circALG1的m6A修飾增強(qiáng)了其與miR?342?5p的結(jié)合能力

研究利用穩(wěn)定沉默了circALG1的SW480細(xì)胞，轉(zhuǎn)染構(gòu)建的野生型和m6A修飾的突變體circALG1質(zhì)粒，進(jìn)行了circALG1的RAP檢測(cè)。結(jié)果顯示，circALG1 m6A修飾的減少，減弱了其與miR-342-5p的結(jié)合（圖7A）。作者還基于野生型和m6A修飾的突變體circALG1序列構(gòu)建了相應(yīng)的螢火蟲熒光素酶質(zhì)粒。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，circALG1 m6A修飾位點(diǎn)的突變?cè)鰪?qiáng)了熒光素酶的表達(dá)，且當(dāng)m6A修飾位點(diǎn)同時(shí)突變時(shí)，熒光強(qiáng)度最高。這些結(jié)果表明miR-342-5p mimics對(duì)含有m6A修飾位點(diǎn)突變序列的circALG1螢火蟲熒光素酶質(zhì)粒表達(dá)的抑制作用減弱，說(shuō)明m6A修飾調(diào)控了circALG1與miR-342-5p的結(jié)合（圖7B）。

然后研究了m6A修飾影響circALG1與miR-342-5p結(jié)合的具體機(jī)制。在下調(diào)蛋白中也觀察到Y(jié)THDF1的存在（圖7C）。此外，在YTHDF1 RIP實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到circALG1的富集（圖7D）。當(dāng)circALG1 m6A修飾位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，YTHDF1 RIP檢測(cè)結(jié)果顯示，富集的circALG1顯著降低，說(shuō)明circALG1與YTHDF1的結(jié)合依賴于m6A修飾（圖7E）。在含有circALG1-mut3序列的螢火蟲熒光素酶質(zhì)粒中，由于缺少m6A修飾位點(diǎn)，METTL3沉默后對(duì)熒光素酶活性沒(méi)有影響（圖7J）。這一結(jié)果也提示m6A修飾可以增強(qiáng)circALG1與miR-342-5p的結(jié)合能力。

圖7 circALG1的m6A修飾增強(qiáng)了其與miR-342-5p的結(jié)合能力

圖8 研究機(jī)制圖

結(jié)論

本研究首先通過(guò)人circRNA芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)circALG1 circALG1通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-342-5p，解除miR-342-5p對(duì)PGF mRNA表達(dá)的抑制作用，促進(jìn)PGF表達(dá)，導(dǎo)致CRC侵襲性增強(qiáng)。YTHDF1在CRC中的高表達(dá)增加了ALG1 pre-mRNA的m6A修飾水平，進(jìn)而增加了circALG1的m6A修飾水平。circALG1的m6A修飾增強(qiáng)其與miR-342-5p的結(jié)合能力，并通過(guò)增強(qiáng)其穩(wěn)定性促進(jìn)circALG1的ceRNA作用。進(jìn)一步促進(jìn)了其ceRNA機(jī)制。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，circALG1可作為早期診斷和抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療的潛在靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

Lin, C., Ma, M., Zhang, Y. et al. The N6-methyladenosine modification of circALG1 promotes the metastasis of colorectal cancer mediated by the miR-342-5p/PGF signalling pathway. Mol Cancer 21, 80 (2022). https://doi.org/10.1186/s12943-022-01560-6