CircSV2b通過miR-5107-5p-Foxk1-Akt1軸參與帕金森病的氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)

研究表明，circRNAs的失調(diào)與神經(jīng)疾病有關(guān)。然而，帕金森?。≒D）中circRNAs的生物發(fā)生、調(diào)節(jié)、功能和機(jī)制仍不清楚。在這項研究中，通過對MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠和野生型小鼠進(jìn)行RNA測序，檢測出了33種差異表達(dá)的circRNAs（DECs）。實時定量PCR檢測紋狀體（STR）、黑質(zhì)致密部（SNpc）和血清外泌體中DECs的RNA水平，發(fā)現(xiàn)PD小鼠中circSV2b下調(diào)。然后，通過體內(nèi)功能實驗，探討circSV2b對PD的影響，機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)circSV2b直接海綿化miR-5107-5p并減輕對靶基因Foxk1表達(dá)的抑制，然后正調(diào)控Akt1轉(zhuǎn)錄。在體內(nèi)， circSV2b過表達(dá)通過ceRNA-Akt1軸抵抗氧化應(yīng)激損傷。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明miR-5107-5p-Foxk1-Akt1軸可能是PD治療中circSV2b過表達(dá)的關(guān)鍵靶點，并強調(diào)了血清外泌體中circSV2b的顯著變化。因此，circSV2b可能是PD診斷和治療的生物標(biāo)記物。本文于2022年8月發(fā)表于“Redox Biology”（IF=10.787）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）MPTP成功誘導(dǎo)小鼠PD的發(fā)生

我們連續(xù)5天腹腔注射MPTP溶液，以建立PD小鼠模型。MPTP降低了STR中DA及其代謝物（DOPAC和HVA）的水平（圖1A-C）。爬桿實驗和步態(tài)分析均表明，MPTP治療會損害小鼠的運動平衡（圖1D-F）。MPTP治療降低了SNpc和STR中TH的表達(dá)，并損傷了多巴胺能神經(jīng)元（圖1G-J）。這些結(jié)果表明，MPTP減弱多巴胺合成，破壞黑質(zhì)紋狀體功能，并誘發(fā)PD的運動癥狀。

2）MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠的circRNA譜分析

RNA測序分析表明，在PD小鼠中發(fā)現(xiàn)8個上調(diào)和25個下調(diào)的circRNAs（圖2A）。這33個circRNAs在STR組織中的存在通過qRT-PCR進(jìn)行了驗證。結(jié)果表明，在25個下調(diào)的circRNAs中，14個下調(diào)，8個上調(diào)，2個不變，1個未檢測到；在8個上調(diào)的circRNA中，5個上調(diào)，2個下調(diào)，1個未檢測到（圖2B）。在SNpc和血清外泌體中評估了19個RNA-seq數(shù)據(jù)(STR中)與qRT-PCR結(jié)果(STR中)一致的circRNAs(圖2C)。CircRNA#3，即circSV2b，其RNA測序（STR中）和qRT-PCR驗證（STR、SNpc和血清中）結(jié)果一致，被選為本研究的目標(biāo)（圖2C）。FISH進(jìn)一步證實，MPTP處理后，SNpc和STR中的circSV2b表達(dá)下調(diào)（圖2D）。CircSV2b來源于小鼠chr7（qD1）上的SV2b基因，由外顯子5–9在轉(zhuǎn)錄后通過頭尾剪接形成（圖2E）。此外，我們設(shè)計了SV2b mRNA的收斂引物和擴(kuò)增circSV2b的特殊發(fā)散引物。我們在cDNA中檢測到一個320 bp的circv2b產(chǎn)物，在提取的gDNA中檢測到一個950 bp的產(chǎn)物(圖2F)。我們使用RNase R來驗證circSV2b的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)circSV2b對RNase R消化有抵抗力（圖2G）。我們通過Sanger測序證實了circSV2b RT-PCR產(chǎn)物中circSV2b的頭尾拼接（圖2H）。

3）過表達(dá)circSV2b改善MPTP誘導(dǎo)的小鼠PD癥狀

我們評估了circSV2b過表達(dá)對PD的保護(hù)作用。注射AAV導(dǎo)致circSV2b過表達(dá)，并且在MPTP治療后，circSV2表達(dá)仍然很高（圖3A）。爬桿實驗和步態(tài)分析都表明，circSV2b的過表達(dá)減輕了受損的運動平衡（圖3B）。circSV2b過表達(dá)部分恢復(fù)了SNpc和STR中MPTP誘導(dǎo)降低的DA水平和TH蛋白水平（圖3C-E）。circSV2b過表達(dá)也逆轉(zhuǎn)了SNpc中TH+神經(jīng)元數(shù)量和STR TH+纖維密度的減少（圖3F和G）。這些結(jié)果表明，circSV2b過表達(dá)可恢復(fù)多巴胺合成，維持黑質(zhì)紋狀體功能，并改善MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠的運動功能。

4）circSV2b通過ceRNA機(jī)制發(fā)揮作用

為了探索circSV2b的亞細(xì)胞定位，我們使用N2A細(xì)胞進(jìn)行FISH染色，并證明circSV2位于N2A細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖4A）。然后我們在組織水平上進(jìn)行了測試。結(jié)果表明，circSV2b主要位于SNpc的細(xì)胞質(zhì)中，MPTP處理導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)circSV2b顯著減少（圖4B）。為了證明circSV2b與AGO2的結(jié)合作用，我們進(jìn)行了熒光共標(biāo)記實驗。結(jié)果表明，circSV2b和AGO2共定位（圖4C）。我們分析了3種circRNA-miRNA預(yù)測工具（miRanda、TargetScan和RNAhybrid）的重疊結(jié)果，確定了13種miRNAs（圖4D）。miRTarBase工具用于預(yù)測miRNA靶基因；只有3個候選miRNAs具有下游靶基因（圖4E）。我們比較了MPTP治療后SNpc組織中候選miRNAs的水平。結(jié)果表明，與其他候選miRNAs相比，MPTP組miR-5107-5p的增加更為顯著（圖4F）。進(jìn)一步使用抗AGO2抗體和circSV2b探針分別進(jìn)行RIP和RNA下拉分析。抗AGO2抗體下拉了circSV2b（圖4G）。此外，miR-5107-5p存在時作用更為明顯（圖4G）。circSV2b探針拉下AGO2蛋白（圖4H）。上述結(jié)果表明，circSV2b作為miRNAs的分子海綿發(fā)揮作用。

因為之前的研究已經(jīng)證實Foxk1是由lncRNA通過ceRNA機(jī)制調(diào)控的，所以在miR-5017-5p的預(yù)測靶基因中，F(xiàn)oxkl被選為下游分子。大多數(shù)circSV2b、miR-5107-5p和AGO2共同定位于細(xì)胞質(zhì)中（圖4I）。我們還進(jìn)行了熒光標(biāo)記實驗，以評估m(xù)iR-5107-5p和Foxk1的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)這兩個分子在細(xì)胞質(zhì)中共存（圖4J）。我們進(jìn)一步使用Foxk1探針進(jìn)行了RNA下拉分析，發(fā)現(xiàn)Foxkl和AGO2結(jié)合（圖4K）。為了證實生物信息學(xué)預(yù)測分析，對N2A細(xì)胞進(jìn)行了雙熒光素酶報告分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染circSV2b-wt的熒光素酶活性在miR-5107-5p模擬物組中顯著降低，在miR-5107-5p抑制劑組中顯著升高（圖4L，M）。另外，轉(zhuǎn)染Foxk1-wt的熒光素酶活性在miR-5107-5p模擬物組中顯著降低，而在miR-5107-5p抑制劑組中升高（圖4N）。上述結(jié)果表明，circSV2b與miR-5107-5p相互作用，miR-5107-25p與mRNA Foxk1相互作用。

5）Foxk1是Akt1的轉(zhuǎn)錄因子

由于氧化應(yīng)激在PD發(fā)病機(jī)制中的重要作用，我們使用CUT和Tag-seq篩選與Foxk1下游氧化應(yīng)激相關(guān)的靶基因。我們對對峰值相關(guān)基因進(jìn)行了GO注釋和富集分析（圖5A和B）。兩個樣本都富含“氧化應(yīng)激反應(yīng)”。在該GO項目中，選擇Akt1的峰值檢測結(jié)果進(jìn)行可視化；2個樣品中的相應(yīng)峰非常接近Akt1的TTS（圖5C）。我們比較了靶峰序列和Foxk1基序，發(fā)現(xiàn)它們是一致的（圖5D）。

6）circSV2b調(diào)節(jié)miR-5107-5p的表達(dá)，miR-5107-25p影響Foxk1的表達(dá)，Foxkl影響Akt1的表達(dá)

為了進(jìn)一步探索ceRNA-Akt1的調(diào)節(jié)作用，我們使用N2A細(xì)胞進(jìn)行了基因編輯實驗。在circSV2b過表達(dá)后，miR-5107-5p和Foxk1的表達(dá)分別下調(diào)和上調(diào)（圖6A）。WB分析顯示，在circSV2b過表達(dá)后，F(xiàn)oxk1和Akt1均上調(diào)（圖6B和C）。我們設(shè)計了3個circSV2b干擾質(zhì)粒。qRT-PCR結(jié)果證實shRNA1的干擾作用最為顯著（圖6D）。qRT-PCR還顯示，在circSV2b干擾后，miR-5107-5p和Foxk1表達(dá)分別上調(diào)和下調(diào)（圖6E）。WB分析顯示，在circSV2b干擾后，F(xiàn)oxk1和Akt1均下調(diào)（圖6F和G）。miR-5107-5p模擬物轉(zhuǎn)染后，F(xiàn)oxk1和Akt1 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)（圖7A-C）。miR-5107-5p抑制劑的轉(zhuǎn)染上調(diào)了Foxk1和Akt1 mRNA和蛋白表達(dá)（圖7D-F）。我們設(shè)計了一個Foxk1過表達(dá)質(zhì)粒。WB結(jié)果表明Foxk1成功過表達(dá)，Akt1表達(dá)上調(diào)（圖7G和H）。我們設(shè)計了3個Foxk1干擾質(zhì)粒。WB結(jié)果表明，shRNA3的干擾效果最好（圖7I和J）。在Foxk1干擾后，F(xiàn)oxkl和Akt1的表達(dá)均下調(diào)（圖7K和L）。

7）circSV2b過表達(dá)通過ceRNA-Akt1途徑緩解PD中的氧化應(yīng)激損傷

為了探索circSV2b過表達(dá)抵抗PD的機(jī)制，我們在AAV注射21天后使用MPTP建立PD小鼠模型。我們評估了ceRNA-Akt1通路中各種分子和氧化應(yīng)激分子的表達(dá)變化。結(jié)果表明，circSV2b過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了MPTP引起的miR-5107-5p的增加，并減輕了Foxk1和Akt mRNA和蛋白表達(dá)的減少（圖8A和B）。CircSV2b過表達(dá)降低了MPTP引起的氧化產(chǎn)物MDA的增加（圖8C），也提高了抗氧化酶（SOD和GSH-PX）的活性（圖8D）。如圖9所示，我們的研究結(jié)果表明，在MPTP條件下，circSV2b過表達(dá)可防止多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)變性和SNpc的氧化應(yīng)激損傷。PD中circSV2b過表達(dá)的神經(jīng)保護(hù)作用可能主要由miR-5107-5p-Foxk1-cAkt1軸介導(dǎo)。此外，circSV2b可以通過外泌體轉(zhuǎn)運到外周血，其水平變化可以在PD模型的血清外泌體中檢測到?？傊覀冏C明了circSV2b可以作為PD診斷的生物標(biāo)記物。此外，circSV2-b過表達(dá)的良好神經(jīng)保護(hù)作用使其成為PD治療的一個很有前景的靶點。

結(jié)論：

circSV2b過表達(dá)通過miR-5107-5p-Foxk1-Akt1信號通路減少氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受損傷，維持黑質(zhì)紋狀體功能，改善運動障礙。血清外泌體中也可檢測到circSV2b的顯著變化。因此，circSV2b是PD治療的理想候選藥物，有助于更好地了解PD的發(fā)病機(jī)制。它還可以作為外周血檢測的分子標(biāo)記物。

參考文獻(xiàn)：

Cheng Q, Wang J, Li M, Fang J, Ding H, Meng J, Zhang J, Fang X, Liu H, Ma C, Chen C, Zhang W. CircSV2b participates in oxidative stress regulation through miR-5107-5p-Foxk1-Akt1 axis in Parkinson's disease. Redox Biol. 2022 Aug 12;56:102430. doi: 10.1016/j.redox.2022.102430.