CircSV2b通過(guò)miR-5107-5p-Foxk1-Akt1軸參與帕金森病的氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)

研究表明，circRNAs的失調(diào)與神經(jīng)疾病有關(guān)。然而，帕金森病（PD）中circRNAs的生物發(fā)生、調(diào)節(jié)、功能和機(jī)制仍不清楚。在這項(xiàng)研究中，通過(guò)對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠和野生型小鼠進(jìn)行RNA測(cè)序，檢測(cè)出了33種差異表達(dá)的circRNAs（DECs）。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)紋狀體（STR）、黑質(zhì)致密部（SNpc）和血清外泌體中DECs的RNA水平，發(fā)現(xiàn)PD小鼠中circSV2b下調(diào)。然后，通過(guò)體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)，探討circSV2b對(duì)PD的影響，機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)circSV2b直接海綿化miR-5107-5p并減輕對(duì)靶基因Foxk1表達(dá)的抑制，然后正調(diào)控Akt1轉(zhuǎn)錄。在體內(nèi)， circSV2b過(guò)表達(dá)通過(guò)ceRNA-Akt1軸抵抗氧化應(yīng)激損傷。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明miR-5107-5p-Foxk1-Akt1軸可能是PD治療中circSV2b過(guò)表達(dá)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，并強(qiáng)調(diào)了血清外泌體中circSV2b的顯著變化。因此，circSV2b可能是PD診斷和治療的生物標(biāo)記物。本文于2022年8月發(fā)表于“Redox Biology”（IF=10.787）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）MPTP成功誘導(dǎo)小鼠PD的發(fā)生

我們連續(xù)5天腹腔注射MPTP溶液，以建立PD小鼠模型。MPTP降低了STR中DA及其代謝物（DOPAC和HVA）的水平（圖1A-C）。爬桿實(shí)驗(yàn)和步態(tài)分析均表明，MPTP治療會(huì)損害小鼠的運(yùn)動(dòng)平衡（圖1D-F）。MPTP治療降低了SNpc和STR中TH的表達(dá)，并損傷了多巴胺能神經(jīng)元（圖1G-J）。這些結(jié)果表明，MPTP減弱多巴胺合成，破壞黑質(zhì)紋狀體功能，并誘發(fā)PD的運(yùn)動(dòng)癥狀。

2）MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠的circRNA譜分析

RNA測(cè)序分析表明，在PD小鼠中發(fā)現(xiàn)8個(gè)上調(diào)和25個(gè)下調(diào)的circRNAs（圖2A）。這33個(gè)circRNAs在STR組織中的存在通過(guò)qRT-PCR進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，在25個(gè)下調(diào)的circRNAs中，14個(gè)下調(diào)，8個(gè)上調(diào)，2個(gè)不變，1個(gè)未檢測(cè)到；在8個(gè)上調(diào)的circRNA中，5個(gè)上調(diào)，2個(gè)下調(diào)，1個(gè)未檢測(cè)到（圖2B）。在SNpc和血清外泌體中評(píng)估了19個(gè)RNA-seq數(shù)據(jù)(STR中)與qRT-PCR結(jié)果(STR中)一致的circRNAs(圖2C)。CircRNA#3，即circSV2b，其RNA測(cè)序（STR中）和qRT-PCR驗(yàn)證（STR、SNpc和血清中）結(jié)果一致，被選為本研究的目標(biāo)（圖2C）。FISH進(jìn)一步證實(shí)，MPTP處理后，SNpc和STR中的circSV2b表達(dá)下調(diào)（圖2D）。CircSV2b來(lái)源于小鼠chr7（qD1）上的SV2b基因，由外顯子5–9在轉(zhuǎn)錄后通過(guò)頭尾剪接形成（圖2E）。此外，我們?cè)O(shè)計(jì)了SV2b mRNA的收斂引物和擴(kuò)增circSV2b的特殊發(fā)散引物。我們?cè)赾DNA中檢測(cè)到一個(gè)320 bp的circv2b產(chǎn)物，在提取的gDNA中檢測(cè)到一個(gè)950 bp的產(chǎn)物(圖2F)。我們使用RNase R來(lái)驗(yàn)證circSV2b的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)circSV2b對(duì)RNase R消化有抵抗力（圖2G）。我們通過(guò)Sanger測(cè)序證實(shí)了circSV2b RT-PCR產(chǎn)物中circSV2b的頭尾拼接（圖2H）。

3）過(guò)表達(dá)circSV2b改善MPTP誘導(dǎo)的小鼠PD癥狀

我們?cè)u(píng)估了circSV2b過(guò)表達(dá)對(duì)PD的保護(hù)作用。注射AAV導(dǎo)致circSV2b過(guò)表達(dá)，并且在MPTP治療后，circSV2表達(dá)仍然很高（圖3A）。爬桿實(shí)驗(yàn)和步態(tài)分析都表明，circSV2b的過(guò)表達(dá)減輕了受損的運(yùn)動(dòng)平衡（圖3B）。circSV2b過(guò)表達(dá)部分恢復(fù)了SNpc和STR中MPTP誘導(dǎo)降低的DA水平和TH蛋白水平（圖3C-E）。circSV2b過(guò)表達(dá)也逆轉(zhuǎn)了SNpc中TH+神經(jīng)元數(shù)量和STR TH+纖維密度的減少（圖3F和G）。這些結(jié)果表明，circSV2b過(guò)表達(dá)可恢復(fù)多巴胺合成，維持黑質(zhì)紋狀體功能，并改善MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠的運(yùn)動(dòng)功能。

4）circSV2b通過(guò)ceRNA機(jī)制發(fā)揮作用

為了探索circSV2b的亞細(xì)胞定位，我們使用N2A細(xì)胞進(jìn)行FISH染色，并證明circSV2位于N2A細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖4A）。然后我們?cè)诮M織水平上進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果表明，circSV2b主要位于SNpc的細(xì)胞質(zhì)中，MPTP處理導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)circSV2b顯著減少（圖4B）。為了證明circSV2b與AGO2的結(jié)合作用，我們進(jìn)行了熒光共標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，circSV2b和AGO2共定位（圖4C）。我們分析了3種circRNA-miRNA預(yù)測(cè)工具（miRanda、TargetScan和RNAhybrid）的重疊結(jié)果，確定了13種miRNAs（圖4D）。miRTarBase工具用于預(yù)測(cè)miRNA靶基因；只有3個(gè)候選miRNAs具有下游靶基因（圖4E）。我們比較了MPTP治療后SNpc組織中候選miRNAs的水平。結(jié)果表明，與其他候選miRNAs相比，MPTP組miR-5107-5p的增加更為顯著（圖4F）。進(jìn)一步使用抗AGO2抗體和circSV2b探針?lè)謩e進(jìn)行RIP和RNA下拉分析。抗AGO2抗體下拉了circSV2b（圖4G）。此外，miR-5107-5p存在時(shí)作用更為明顯（圖4G）。circSV2b探針拉下AGO2蛋白（圖4H）。上述結(jié)果表明，circSV2b作為miRNAs的分子海綿發(fā)揮作用。

因?yàn)橹暗难芯恳呀?jīng)證實(shí)Foxk1是由lncRNA通過(guò)ceRNA機(jī)制調(diào)控的，所以在miR-5017-5p的預(yù)測(cè)靶基因中，F(xiàn)oxkl被選為下游分子。大多數(shù)circSV2b、miR-5107-5p和AGO2共同定位于細(xì)胞質(zhì)中（圖4I）。我們還進(jìn)行了熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估m(xù)iR-5107-5p和Foxk1的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)分子在細(xì)胞質(zhì)中共存（圖4J）。我們進(jìn)一步使用Foxk1探針進(jìn)行了RNA下拉分析，發(fā)現(xiàn)Foxkl和AGO2結(jié)合（圖4K）。為了證實(shí)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析，對(duì)N2A細(xì)胞進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染circSV2b-wt的熒光素酶活性在miR-5107-5p模擬物組中顯著降低，在miR-5107-5p抑制劑組中顯著升高（圖4L，M）。另外，轉(zhuǎn)染Foxk1-wt的熒光素酶活性在miR-5107-5p模擬物組中顯著降低，而在miR-5107-5p抑制劑組中升高（圖4N）。上述結(jié)果表明，circSV2b與miR-5107-5p相互作用，miR-5107-25p與mRNA Foxk1相互作用。

5）Foxk1是Akt1的轉(zhuǎn)錄因子

由于氧化應(yīng)激在PD發(fā)病機(jī)制中的重要作用，我們使用CUT和Tag-seq篩選與Foxk1下游氧化應(yīng)激相關(guān)的靶基因。我們對(duì)對(duì)峰值相關(guān)基因進(jìn)行了GO注釋和富集分析（圖5A和B）。兩個(gè)樣本都富含“氧化應(yīng)激反應(yīng)”。在該GO項(xiàng)目中，選擇Akt1的峰值檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行可視化；2個(gè)樣品中的相應(yīng)峰非常接近Akt1的TTS（圖5C）。我們比較了靶峰序列和Foxk1基序，發(fā)現(xiàn)它們是一致的（圖5D）。

6）circSV2b調(diào)節(jié)miR-5107-5p的表達(dá)，miR-5107-25p影響Foxk1的表達(dá)，Foxkl影響Akt1的表達(dá)

為了進(jìn)一步探索ceRNA-Akt1的調(diào)節(jié)作用，我們使用N2A細(xì)胞進(jìn)行了基因編輯實(shí)驗(yàn)。在circSV2b過(guò)表達(dá)后，miR-5107-5p和Foxk1的表達(dá)分別下調(diào)和上調(diào)（圖6A）。WB分析顯示，在circSV2b過(guò)表達(dá)后，F(xiàn)oxk1和Akt1均上調(diào)（圖6B和C）。我們?cè)O(shè)計(jì)了3個(gè)circSV2b干擾質(zhì)粒。qRT-PCR結(jié)果證實(shí)shRNA1的干擾作用最為顯著（圖6D）。qRT-PCR還顯示，在circSV2b干擾后，miR-5107-5p和Foxk1表達(dá)分別上調(diào)和下調(diào)（圖6E）。WB分析顯示，在circSV2b干擾后，F(xiàn)oxk1和Akt1均下調(diào)（圖6F和G）。miR-5107-5p模擬物轉(zhuǎn)染后，F(xiàn)oxk1和Akt1 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)（圖7A-C）。miR-5107-5p抑制劑的轉(zhuǎn)染上調(diào)了Foxk1和Akt1 mRNA和蛋白表達(dá)（圖7D-F）。我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)Foxk1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。WB結(jié)果表明Foxk1成功過(guò)表達(dá)，Akt1表達(dá)上調(diào)（圖7G和H）。我們?cè)O(shè)計(jì)了3個(gè)Foxk1干擾質(zhì)粒。WB結(jié)果表明，shRNA3的干擾效果最好（圖7I和J）。在Foxk1干擾后，F(xiàn)oxkl和Akt1的表達(dá)均下調(diào)（圖7K和L）。

7）circSV2b過(guò)表達(dá)通過(guò)ceRNA-Akt1途徑緩解PD中的氧化應(yīng)激損傷

為了探索circSV2b過(guò)表達(dá)抵抗PD的機(jī)制，我們?cè)?/span>AAV注射21天后使用MPTP建立PD小鼠模型。我們?cè)u(píng)估了ceRNA-Akt1通路中各種分子和氧化應(yīng)激分子的表達(dá)變化。結(jié)果表明，circSV2b過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了MPTP引起的miR-5107-5p的增加，并減輕了Foxk1和Akt mRNA和蛋白表達(dá)的減少（圖8A和B）。CircSV2b過(guò)表達(dá)降低了MPTP引起的氧化產(chǎn)物MDA的增加（圖8C），也提高了抗氧化酶（SOD和GSH-PX）的活性（圖8D）。如圖9所示，我們的研究結(jié)果表明，在MPTP條件下，circSV2b過(guò)表達(dá)可防止多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)變性和SNpc的氧化應(yīng)激損傷。PD中circSV2b過(guò)表達(dá)的神經(jīng)保護(hù)作用可能主要由miR-5107-5p-Foxk1-cAkt1軸介導(dǎo)。此外，circSV2b可以通過(guò)外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)到外周血，其水平變化可以在PD模型的血清外泌體中檢測(cè)到。總之，我們證明了circSV2b可以作為PD診斷的生物標(biāo)記物。此外，circSV2-b過(guò)表達(dá)的良好神經(jīng)保護(hù)作用使其成為PD治療的一個(gè)很有前景的靶點(diǎn)。

結(jié)論：

circSV2b過(guò)表達(dá)通過(guò)miR-5107-5p-Foxk1-Akt1信號(hào)通路減少氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受損傷，維持黑質(zhì)紋狀體功能，改善運(yùn)動(dòng)障礙。血清外泌體中也可檢測(cè)到circSV2b的顯著變化。因此，circSV2b是PD治療的理想候選藥物，有助于更好地了解PD的發(fā)病機(jī)制。它還可以作為外周血檢測(cè)的分子標(biāo)記物。

參考文獻(xiàn)：

Cheng Q, Wang J, Li M, Fang J, Ding H, Meng J, Zhang J, Fang X, Liu H, Ma C, Chen C, Zhang W. CircSV2b participates in oxidative stress regulation through miR-5107-5p-Foxk1-Akt1 axis in Parkinson's disease. Redox Biol. 2022 Aug 12;56:102430. doi: 10.1016/j.redox.2022.102430.