國(guó)自然熱點(diǎn)之m7G:METTL1/WDR4介導(dǎo)的tRNA m7G修飾調(diào)控mRNA翻譯驅(qū)動(dòng)頭頸部鱗癌
N7 -甲基鳥(niǎo)苷(m7G)是一種最常見(jiàn)的RNA表觀修飾，常位于真核生物mRNA的5’帽和內(nèi)部位置，或所有物種的rRNA和tRNA內(nèi)部。m7G修飾通過(guò)影響各種RNA分子的代謝，包括mRNA、tRNA、microRNA和核糖體RNA。越來(lái)越多的證據(jù)表明，m7G在人類疾病的發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。目前m7G中標(biāo)的項(xiàng)目越來(lái)越多，但又不會(huì)像其他熱點(diǎn)一樣被研究的很泛濫，因此不失為基金申請(qǐng)的好方向。下圖為22年部分m7G中標(biāo)項(xiàng)目的題目：
那么，如何在課題中引入和研究m7G修飾呢？下面，我們通過(guò)一篇最新高分文章解讀來(lái)了解。
癌細(xì)胞選擇性地促進(jìn)致癌轉(zhuǎn)錄物的翻譯以刺激癌癥進(jìn)展。盡管越來(lái)越多的證據(jù)表明tRNA修飾和相關(guān)基因參與了這一過(guò)程，但它們?cè)陬^頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)中的作用在很大程度上仍未得到表征。在這里，作者試圖研究轉(zhuǎn)移RNA(tRNA) N7-甲基鳥(niǎo)苷(m7G)修飾在調(diào)節(jié)HNSCC發(fā)生和發(fā)展中的功能和機(jī)制。該研究于2022年3月發(fā)表在《Cancer Communications》，IF：15.283。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1. METTL1和WDR4上調(diào)并與HNSCC患者的不良預(yù)后相關(guān)
分析m7G tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物組分METTL1和WDR4的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)METTL1和WDR4在HNSCC中顯著上調(diào)并呈正相關(guān)(r=0.53) (圖1A和B)。METTL1或WDR4高表達(dá)的患者總生存期(OS)較短(圖1C)。為進(jìn)一步驗(yàn)證，作者對(duì)140個(gè)HNSCC組織和69個(gè)正常組織進(jìn)行免疫組化(IHC)染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)METTL1和WDR4主要在細(xì)胞核中表達(dá)，HNSCC組織中METTL1和WDR4的表達(dá)水平顯著高于正常組織(圖1D和E)。METTL1或WDR4蛋白高表達(dá)的患者的OS短于METTL1或WDR4蛋白低表達(dá)的患者(圖1F)。在這些HNSCC組織中也發(fā)現(xiàn)了METTL1和WDR4表達(dá)水平之間存在顯著相關(guān)性(圖1G)。通過(guò)Western blotting和qRT-PCR證實(shí)METTL1和WDR4在HNSCC組織中的顯著高表達(dá)，并且根據(jù)anti-m7G Northwestern blotting，HNSCC組織中的m7G修飾水平相應(yīng)高于相鄰正常組織中的修飾水平(圖1H和I)。因此，作者推測(cè)METTL1和WDR4可能與HNSCC進(jìn)展有關(guān)，并與HNSCC患者的預(yù)后不良有關(guān)。
圖1. METTL1和WDR4上調(diào)并與HNSCC患者的不良預(yù)后相關(guān)
2. HNSCC在體外和體內(nèi)的進(jìn)展都需要METTL1/WDR4
檢測(cè)了5個(gè)HNSCC細(xì)胞系中的METTL1表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)所有HNSCC細(xì)胞系的METTL1蛋白水平均高于HOK細(xì)胞(圖2A)。在SCC9和SCC15細(xì)胞系中使用sgRNA敲除METTL1基因(圖2B)，發(fā)現(xiàn)敲除SCC9和SCC15細(xì)胞中的METTL1可抑制細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和集落形成并促進(jìn)細(xì)胞凋亡(圖2C-G)。細(xì)胞周期分析顯示，與METTL1-WT組相比，METTL1-KO組G1期細(xì)胞百分比顯著增加(圖2H)。使用原位移植模型進(jìn)一步研究了METTL1在體內(nèi)的致癌功能。METTL1-KO細(xì)胞形成的腫瘤生長(zhǎng)較慢，腫瘤體積明顯小于METTL1-WT細(xì)胞形成的腫瘤(圖2I和J)。IHC染色顯示敲除METTL1導(dǎo)致泛細(xì)胞角蛋白(PCK)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(LN)顯著減少(圖2K)?？傮w而言，數(shù)據(jù)表明METTL1和WDR4在HNSCC的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中充當(dāng)癌基因。
圖2. METTL1是HNSCC在體外和體內(nèi)進(jìn)展所必需的
3. METTL1介導(dǎo)的m7G tRNA修飾調(diào)節(jié)HNSCC中的mRNA翻譯和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路
為探究METTL1調(diào)節(jié)HNSCC進(jìn)展的機(jī)制，首先檢測(cè)了METTL1-KO或敲低WDR4細(xì)胞中的tRNA m7G信號(hào)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除METTL1或敲除WDR4導(dǎo)致tRNA m7G修飾水平降低(圖3A)。利用TRAC-seq分析了SCC15細(xì)胞中全局m7G tRNA修飾的單核苷酸分辨率圖譜。在tRNA的V環(huán)內(nèi)共鑒定出16個(gè)含有m7G修飾的HNSCC和“RRGGYYS”基序的tRNA(圖3B和C)。與METTL1-WT組相比，METTL1-KO顯著降低了已鑒定tRNA的m7G tRNA修飾水平(圖3D和E)。非m7G修飾的tRNA水平?jīng)]有顯著改變，但大多數(shù)m7G修飾的tRNA表達(dá)水平降低(圖3F和G)。Northern blotting證實(shí)m7G修飾的tRNA(如ValACC和ThrTGT)的表達(dá)水平降低，而未修飾的tRNA(ProAGG)的表達(dá)水平保持不變(圖3H）。多核糖體分析結(jié)果表明，METTL1敲除導(dǎo)致多核糖體峰減少，表明METTL1-KO細(xì)胞中的全局翻譯受到抑制(圖3I)。嘌呤霉素?cái)z取試驗(yàn)表明，嘌呤霉素在METTL1-KO細(xì)胞中的摻入顯著減少(圖3J)。接著作者進(jìn)行了挽救實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)野生型METTL1(但不是催化失活突變體)的過(guò)表達(dá)挽救了METTL1-KO細(xì)胞中受損的mRNA翻譯(圖3K)。核糖體足印結(jié)果發(fā)現(xiàn)METTL1的缺失增加了m7G tRNA的密碼子依賴性核糖體暫停(圖3L)，表明METTL1介導(dǎo)的m7G tRNA修飾對(duì)于m7G tRNA解碼密碼子的核糖體轉(zhuǎn)換過(guò)程中的有效密碼子識(shí)別是必要的。密碼子頻率分析顯示，翻譯效率(TE)降低的mRNA具有顯著更高的m7G修飾tRNA解碼密碼子頻率(圖3M)。
為確定METTL1介導(dǎo)的m7G tRNA修飾的下游mRNA靶標(biāo)，作者進(jìn)行RNC-seq以研究主動(dòng)翻譯的mRNA，并鑒定了3945個(gè)減少翻譯的mRNAs和2172個(gè)增加翻譯的mRNAs(圖4A)。KEGG富集分析和GSEA顯示PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在METTL1調(diào)控的基因中持續(xù)富集(圖4B和C)。Western blotting結(jié)果表明，METTL1-KO細(xì)胞中的PI3K蛋白水平以及AKT和mTOR的磷酸化水平顯著降低(圖4D)。進(jìn)一步檢測(cè)了下游蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在METTL1-KO細(xì)胞中，Cyclin D1、Vimentin、MMP9、Bcl-2和P-S6K的表達(dá)顯著降低，而B(niǎo)AX的表達(dá)顯著上調(diào)(圖4D)。此外，qRT-PCR分析表明，敲除METTL1幾乎不影響PIK3CA的轉(zhuǎn)錄，但顯著降低了PIK3CA的翻譯(圖4E)。通過(guò)過(guò)表達(dá)PIK3CA或在METTL1-KO細(xì)胞中用AKT激活劑SC79處理進(jìn)行了拯救實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這兩種方法都部分逆轉(zhuǎn)了敲除METTL1對(duì)HNSCC細(xì)胞的影響(圖4F-I)。
圖3. METTL1介導(dǎo)的m7G tRNA修飾調(diào)節(jié)HNSCC中的tRNA表達(dá)和mRNA翻譯
圖4. METTL1介導(dǎo)的m7G tRNA修飾調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的活性
4. 轉(zhuǎn)基因小鼠模型證實(shí)Mettl1-PI3K/Akt/mTOR是HNSCC致癌和轉(zhuǎn)移所必需的
為探索Mettl1在自發(fā)HNSCC中的作用，作者生成了Mettl1cKO-Ctrl和Mettl1cKO小鼠，能夠特異性地敲除小鼠口腔上皮中的Mettl1表達(dá)。用4NQO治療小鼠16周以發(fā)展為HNSCC，然后在12周后實(shí)施安樂(lè)死以收集它們的舌頭和頸部淋巴結(jié)。首先通過(guò)IHC染色驗(yàn)證了Mettl1在口腔上皮中的敲除效率(圖5A)。與Mettl1cKO-Ctrl小鼠相比，Mettl1cKO小鼠出現(xiàn)的臨床可見(jiàn)病變更少且更小(圖5B)。Mettl1cKO-Ctrl和Mettl1cKO小鼠的可見(jiàn)病變數(shù)量分別為3.7±0.3和2.8±0.2(圖5C)。此外，Mettl1cKO小鼠的組織病理學(xué)分級(jí)低于Mettl1cKO-Ctrl小鼠(圖5D)。Mettl1cKO小鼠在病變中表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制增殖能力(Ki67)和更低的轉(zhuǎn)移能力(PCK、LN) (圖5E和F)。用4NQO治療Mettl1cKI和Mettl1cKI-Ctrl小鼠以促進(jìn)HNSCC的發(fā)展。IHC染色顯示Mettl1cKI小鼠的上皮細(xì)胞表現(xiàn)出比Mettl1cKI-Ctrl小鼠更強(qiáng)的Mettl1陽(yáng)性信號(hào)(圖5G)。定量分析顯示，Mettl1cKI小鼠出現(xiàn)更多病變，病變面積更大(圖5H和I)。來(lái)自Mettl1cKI小鼠的腫瘤比來(lái)自Mettl1cKI-Ctrl小鼠的腫瘤具有更高的組織病理學(xué)分級(jí)和更高的增殖和轉(zhuǎn)移能力(圖5J-L)。
為進(jìn)一步了解Mettl1如何在體內(nèi)調(diào)節(jié)HNSCC進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，從兩對(duì)Mettl1cKO和Mettl1cKO-Ctrl小鼠中收集了HNSCC組織，并使用10X Genomics Chromium平臺(tái)進(jìn)行了scRNA-seq。經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制和過(guò)濾，總共獲得18,665個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。進(jìn)一步的無(wú)監(jiān)督聚類確定了HNSCC上皮細(xì)胞以及基質(zhì)亞型，包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞(圖6A)。重新聚集上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與Mettl1cKO-Ctrl小鼠相比，Mettl1cKO小鼠中的Mettl1基因下調(diào)(圖6B和C)。此外，上皮細(xì)胞GSVA的結(jié)果顯示，在Mettl1cKO HNSCC樣本中PI3K/Akt活化顯著降低(圖6D)。用抗HA抗體免疫沉淀mRNA從舌病變中翻譯出來(lái)，發(fā)現(xiàn)與在K14CreER;RiboTag;Mettl1wt/wt小鼠中相比，在K14CreER;RiboTag;Mettl1fl/fl小鼠中Pik3ca基因的表達(dá)降低(圖6E)。用BKM120治療的Mettl1cKI小鼠出現(xiàn)更少的病變，病變面積減少，浸潤(rùn)性癌減少，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移減少(圖6F-H)。
圖5. 轉(zhuǎn)基因小鼠模型證實(shí)Mettl1是HNSCC致癌和轉(zhuǎn)移所必需的
圖6. 轉(zhuǎn)基因小鼠模型證實(shí)Mettl1調(diào)節(jié)HNSCC中的PI3K/Akt/mTOR活性
5. 敲除Mettl1后HNSCC微環(huán)境改變的scRNA-seq分析
腫瘤浸潤(rùn)性骨髓細(xì)胞是HNSCC微環(huán)境的重要組成部分。分析scRNA-seq數(shù)據(jù)以進(jìn)一步檢查敲除Mettl1后HNSCC中免疫細(xì)胞的情況?？偣舶l(fā)現(xiàn)471個(gè)骨髓細(xì)胞，它們被分為7個(gè)亞群：中性粒細(xì)胞、C-X3-C基序趨化因子受體1(Cx3cr1+)巨噬細(xì)胞、甘露糖受體C1型(Mrc1+)巨噬細(xì)胞、巨噬細(xì)胞-3(Macro-3)細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞和遷移細(xì)胞。值得注意的是，與Mettl1cKO-Ctrl相比，Mettl1cKO HNSCC中的Mrc1+巨噬細(xì)胞、Macro-3細(xì)胞和朗格漢斯細(xì)胞的比例升高(圖7A-C)。此外，確定了總共1,013個(gè)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)，它們被聚集成七個(gè)不同的亞群，分別是CD4記憶T、CD4+幼稚T、CD4+T耗竭、CD8+初始T、自然殺傷細(xì)胞(NKT)、T輔助17(Th17)和調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞(圖7D-F)。量化每個(gè)亞簇的細(xì)胞數(shù)量和比例，發(fā)現(xiàn)Mettl1cKO HNSCC樣本中的CD4+T耗竭和Treg顯著減少(圖7E)。如圖7G所示，在Mettl1cKO HNSCC樣本中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)受體-配體對(duì)的抑制作用，包括白細(xì)胞介素1β(Il1b)-白細(xì)胞介素1受體2型(Il1r2)和Il1b-腎上腺素受體2(Adrb2)。這些數(shù)據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞中Mettl1的敲除導(dǎo)致癌細(xì)胞與其微環(huán)境之間的通訊發(fā)生改變。
圖7. 敲除Mettl1后HNSCC腫瘤中腫瘤細(xì)胞-微環(huán)境串?dāng)_的scRNA-seq分析
結(jié)論：
作者發(fā)現(xiàn)tRNA m7G甲基轉(zhuǎn)移酶METTL1通過(guò)調(diào)節(jié)整體mRNA翻譯(包括PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路)促進(jìn)HNSCC的發(fā)展和惡性，并改變HNSCC的免疫景觀。METTL1可能是HNSCC患者的一個(gè)有希望的治療靶點(diǎn)。