長鏈非編碼 RNA MIR4435-2HG通過重編程中性粒細胞抑制結直腸癌的發(fā)生和進展

作為全球惡性腫瘤的第三大病因，結直腸癌在起始和進展階段受lncRNA異常表達和突變的調控。之前的研究發(fā)現(xiàn)MIR4435-2HG作為多種腫瘤類型的癌基因,但MIR4435-2HG在腫瘤基質或微環(huán)境中的作用及其詳細的調控機制，仍然未知。髓源性抑制細胞 (MDSC) 是一種異質細胞群，包括病理活化的單核細胞和相對不成熟的中性粒細胞，lncRNAs 在 MDSCs 中的作用尚未得到詳細闡明。該研究發(fā)表于《Cancer Immunology Research》，IF:12.02。

技術路線：

主要研究結果：

1. 腫瘤細胞內的MIR4435-2HG在體外對結直腸癌細胞沒有生物學作用

為了探索MIR4435-2HG在結直腸癌中的作用，作者分析了來自癌癥基因組圖譜 (TCGA) 和符合條件的基因表達綜合 (GEO) 數(shù)據(jù)庫的 10 個公共數(shù)據(jù)集（包括 10 多對正常-腫瘤結直腸癌樣本），結果顯示在 7 個數(shù)據(jù)集中，與成對的相鄰正常組織相比，MIR4435-2HG在腫瘤組織中上調。因此，作者進行了薈萃分析以確認MIR4435-2HG在結直腸癌中過表達（圖 1A）。

接下來，作者檢測了MIR4435-2HG在結直腸癌細胞系中的表達和亞細胞定位。MIR4435-2HG在 SW480 和 RKO 細胞的細胞核和細胞質中均具有較高的表達。作者通過 SW480 細胞中的 CRISPR/Cas9 敲除MIR4435-2HG，并通過 SW480 和 RKO 細胞中的 siRNA 敲低MIR4435-2HG。在結腸直腸癌細胞中敲除或敲除MIR4435-2HG對增殖、遷移或侵襲均沒有影響。與這些發(fā)現(xiàn)一致，MIR4435-2HG的異位表達在 DLD1 和 HCT116 細胞中沒有改變它們的增殖、遷移或侵襲。RNA范圍顯示MIR4435-2HG在腫瘤基質中高表達，但在結直腸癌細胞和鄰近的正常上皮細胞中表達非常低（圖1B），這可能解釋了為什么MIR4435-2HG在腫瘤組織中高表達但沒有生物學效應在結直腸癌細胞內。

2. Mir4435-2hg缺失促進結直腸腫瘤發(fā)生和進展

目前尚不清楚腫瘤基質中的MIR4435-2HG是否在結直腸癌發(fā)展中發(fā)揮生物學作用。作者通過 CRISPR/Cas9 刪除Mir4435-2hg基因座產(chǎn)生了Mir4435-2hg 缺陷小鼠。與之前的報告一致，Mir4435-2hg的缺失導致中性粒細胞、單核細胞和嗜酸性粒細胞減少，但淋巴細胞不減少。刪除Mir4435-2hg后未觀察到其他主要器官發(fā)育或血脂異常的明顯改變。然后，作者將小鼠結腸炎相關（AOM/DSS）結直腸癌模型分為三個隊列，包括短期、經(jīng)典長期和長期腫瘤模型（圖 1C），它們在分子水平上類似于人類結直腸癌的進展，包括Apc突變和 β-連環(huán)蛋白易位。雖然短期腫瘤模型的結直腸腺瘤不足以進行肉眼觀察，但 H&E 染色顯示Mir4435-2hg -/-小鼠比野生型 (WT) 小鼠攜帶更多的結直腸腺瘤和淋巴濾泡（圖 1D - F）。通過經(jīng)典術語模型的大體觀察和 H&E 染色，作者在Mir4435-2hg -/-小鼠中發(fā)現(xiàn)比 WT 小鼠更多的腫瘤、更大的腫瘤大小和更高的腫瘤負荷（圖 1G - K）。然而，長期模型的大體觀察和 H&E 染色均未顯示Mir4435-2hg -/-小鼠和 WT 小鼠之間的腫瘤數(shù)量或腫瘤大小存在顯著差異（圖 1L - O）。進一步的組織學分析（圖 1M）顯示所有來自Mir4435-2hg -/-小鼠的腫瘤，但只有 40% 來自 WT 小鼠，已穿透黏膜肌層進入黏膜下層（圖 1P ））。另一組 AOM/DSS 模型接受了生存分析（第 30 周），而Mir4435-2hg -/-小鼠的生存率較差（圖 1Q）。

接下來，將Apc Min/ +小鼠（一種自發(fā)性腸腺瘤性息肉病的動物模型）與Mir4435-2hg -/-小鼠雜交以模擬自發(fā)性腫瘤。在來自Apc Min/ +小鼠的正常組織中，在腸腫瘤中檢測到更高的 Mir4435-2hg表達。然而，在Apc Min/ + / Mir4435-2hg -/-小鼠中觀察到更多的腸腫瘤（圖 1R）。作者還發(fā)現(xiàn)Apc Min/ + / Mir4435-2hg-/-小鼠的預后比Apc Min/ + /WT 小鼠差（圖 1S）。總之，這些數(shù)據(jù)表明Mir4435-2hg缺失有助于散發(fā)性結直腸腫瘤的發(fā)生和進展，應被視為腫瘤抑制 lncRNA。

圖1 Mir4435-2hg缺失促進結直腸腫瘤的發(fā)生和進展

3. MIR4435-2HG通過重塑免疫微環(huán)境來調節(jié)結直腸癌的發(fā)展

為了證明Mir4435-2hg如何調節(jié)結直腸癌的進展，作者通過 RNA-seq 對來自 WT 和Mir4435-2hg -/- AOM/DSS 小鼠的腫瘤組織進行了轉錄組分析。Mir4435-2hg缺失導致 92 個基因顯著上調，138 個基因顯著下調（圖 2A），通過 qRT-PCR 進一步驗證了它們的代表性基因。根據(jù)基因本體（GO）富集分析，這些差異表達的基因主要富集于免疫反應生物學過程，包括炎癥反應、中性粒細胞趨化性、免疫系統(tǒng)過程、抗原加工和呈遞（圖2B和C）。

為了排除 AOM/DSS 誘導的結腸炎引起的副作用，作者還收集了Apc Min/ + / Mir4435-2hg -/-和Apc Min/ + /WT 小鼠的腫瘤組織用于 RNA-seq 分析。與 AOM/DSS 模型一致，上調基因的 GO 富集分析表明，大多數(shù)基因與腫瘤免疫相關生物學過程相關，例如淋巴細胞趨化性、對干擾素-γ 的細胞反應、炎癥反應和中性粒細胞趨化性。這些數(shù)據(jù)進一步支持了Mir4435-2hg可能通過調節(jié)結直腸癌的免疫微環(huán)境發(fā)揮抑癌作用。

為了驗證這一假設，將同系鼠結腸直腸癌細胞系 MC38 皮下接種到Mir4435-2hg -/-和 WT 小鼠中。作者發(fā)現(xiàn)腫瘤在Mir4435-2hg -/-小鼠中生長得更快（圖 2D）。Mir4435-2hg -/-小鼠的腫瘤體積和重量也顯著大于WT小鼠（圖2E和F），Mir4435-2hg -/-小鼠的腫瘤形成率顯著高于WT小鼠。

為了進一步證明腫瘤基質中而非腫瘤細胞中的 Mir4435-2hg 調節(jié)結直腸癌的發(fā)展，作者用 CRISPR/Cas9 敲除MC38細胞中的Mir4435-2hg。Mir4435-2hg敲除沒有改變它們的增殖、遷移或侵襲。MC38 和 CT26 細胞中三種Mir4435-2hg變體的過表達對增殖和遷移也幾乎沒有影響。將 Mir4435-2hg敲除 MC38 和模擬敲除細胞同步注射到Mir4435-2hg -/-和 WT 小鼠中。淘汰Mir4435-2hg在 MC38 細胞中不影響Mir4435-2hg -/-或 WT 小鼠的腫瘤增殖；然而，Mir4435-2hg -/-小鼠的微環(huán)境顯著促進了腫瘤的生長，不僅是模擬細胞，還有Mir4435-2hg敲除 MC38 細胞（圖 2G）。腫瘤體積和重量也觀察到類似的表型（圖 2H和I）。接下來，作者從Mir4435-2hg -/-和 WT 小鼠中分離脾細胞以與 MC38 細胞共培養(yǎng)。正如預期的那樣，與脾細胞共培養(yǎng)時，MC38細胞的凋亡率更高，但Mir4435-2hg的脾細胞降低了MC38細胞的凋亡率。-/-小鼠與 WT 小鼠相比（圖 2J和K）。

總體而言，這些數(shù)據(jù)表明MIR4435-2HG可能通過重塑結直腸癌免疫微環(huán)境發(fā)揮抗癌作用。

圖2 MIR4435-2HG通過重塑免疫微環(huán)境來調節(jié)結直腸癌的發(fā)展

4. Mir4435-2hg耗竭增加結直腸癌中的 PMN-MDSCs

Mir4435-2hg可以通過等位基因特異性抑制Bim表達來控制嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和單核細胞的壽命。然而，目前尚不清楚結直腸癌基質中哪種類型的細胞表達Mir4435-2hg。因此，作者在人結直腸癌組織中進行了 RNAscope 分析，結果表明MIR4435-2HG主要位于中性粒細胞中（圖 3A）。接下來，作者監(jiān)測了皮下腫瘤生長過程中外周血中主要白細胞的數(shù)量變化。與以前的報告一致，荷瘤小鼠的中性粒細胞、單核細胞和嗜酸性粒細胞增加，淋巴細胞減少。Mir4435-2hg -/-小鼠的單核細胞和嗜酸性粒細胞仍然低于WT小鼠，但隨著腫瘤的生長，Mir4435-2hg -/-小鼠的中性粒細胞數(shù)量逐漸達到與WT小鼠相同的頻率（圖3B）。

荷瘤小鼠中的中性粒細胞是異源的，包括經(jīng)典的中性粒細胞和 PMN-MDSCs。根據(jù)作者上面的數(shù)據(jù)，作者假設Mir4435-2hg不能控制 PMN-MDSC 的壽命，并且攜帶腫瘤的Mir4435-2hg -/-小鼠中升高的中性粒細胞主要是 PMN-MDSC。因此，作者在無腫瘤和有腫瘤的 WT 和Mir4435-2hg -/-小鼠中檢測到中性粒細胞的凋亡。無腫瘤Mir4435-2hg -/-小鼠的中性粒細胞凋亡明顯多于 WT 小鼠。然而，在荷瘤小鼠中，Mir4435-2hg中的中性粒細胞凋亡減少-/-和 WT 小鼠，這可能是由 MC38 細胞產(chǎn)生的 GM-CSF 造成的，在荷瘤Mir4435-2hg -/-小鼠中，中性粒細胞凋亡率降低到與荷瘤 WT 小鼠相同的水平（圖 3C和D）。在BM衍生的PMN-MDSCs中，作者還觀察到在用MC38腫瘤細胞培養(yǎng)基處理后細胞凋亡率降低，尤其是在Mir4435-2hg -/-細胞中（圖3E）。

因為Mir4435-2hg通過抑制Bim表達來調節(jié)中性粒細胞凋亡，作者檢測到 BIM 蛋白在中性粒細胞中的表達。BIM 在無腫瘤和攜帶腫瘤的Mir4435-2hg -/-小鼠中均上調，并且攜帶腫瘤不改變 BIM 的表達（圖 3F和G）。Bcl2 家族通過形成同源二聚體或異源二聚體來調節(jié)細胞凋亡。因此，作者檢測到所有抗凋亡 Bcl2 家族成員的變化。其中，來自 WT 或Mir4435-2hg -/-小鼠的 BM 衍生的 PMN-MDSC 中只有Bcl2l1通過 MC38 腫瘤細胞培養(yǎng)基的刺激而上調（圖 3H），而Bcl2和Bcl2a1a被下調，而Bcl2l2和Mcl1未改變。流式細胞術還顯示來自 WT 和Mir4435-2hg -/-荷瘤小鼠的中性粒細胞中 BCL2L1 的表達升高（圖 3I和J）。這些結果表明，PMN-MDSCs 中 BCL2L1 的表達升高可能會拮抗 Mir4435-2hg -/- 小鼠中增加的 BIM 的功能，幫助荷瘤Mir4435-2hg -/-小鼠中的中性粒細胞恢復到與在WT小鼠中并導致更高比例的PMN-MDSC。

圖3 Mir4435-2hg消耗增加 PMN-MDSC

單細胞 RNA-seq 分析已將 CD14 鑒定為 PMN-MDSCs 的標志物，用于區(qū)分荷瘤小鼠中的經(jīng)典中性粒細胞。在作者的研究中，在攜帶腫瘤的Mir4435-2hg -/-小鼠的脾中性粒細胞中觀察到的 CD14 +細胞比例顯著高于來自 WT 小鼠的那些。即使在無腫瘤小鼠中，Mir4435-2hg -/-小鼠也比WT小鼠攜帶更高比例的CD14 +中性粒細胞（圖3K和L）。作者還通過流式細胞術研究了皮下腫瘤內幾種類型的腫瘤浸潤免疫細胞。在Mir4435-2hg中檢測到更高比例的中性粒細胞-/-小鼠比 WT 小鼠（圖 4A）。在中性粒細胞室內，CD14 +細胞的百分比在 WT 小鼠中達到平均 85.7%，在Mir4435-2hg -/-小鼠中達到 93.0%（圖4B），這表明腫瘤浸潤性中性粒細胞主要是增加的 PMN-MDSCs在Mir4435-2hg -/-小鼠的腫瘤內。相反，CD3 + T 細胞和 CD8 + T 細胞減少（圖 4C和D）。Mir4435-2hg -/-小鼠的單核細胞/M-MDSCs 也顯著減少，而總 CD45 +細胞、巨噬細胞和 M2 巨噬細胞沒有改變（圖4E-H）。在 AOM/DSS 結直腸癌模型中也觀察到了類似的結果；通過IHC，與WT小鼠相比，Mir4435-2hg -/-小鼠的腫瘤浸潤性PMN-MDSCs顯著增加，CD8 + T細胞減少（圖4I）。這些數(shù)據(jù)表明，Mir4435-2hg的丟失可能導致 PMN-MDSCs 的增加，這有助于免疫抑制環(huán)境。

圖4 Mir4435-2hg耗竭導致腫瘤浸潤性 PMN-MDSC 增加和 T 細胞減少

5. Mir4435-2hg 的缺失增強了 PMN-MDSCs 的免疫抑制潛力

為了研究Mir4435-2hg調節(jié) PMN-MDSCs 的生物學機制，作者對來自 BM 的中性粒細胞進行了 RNA-seq，結果顯示 429 個下調基因和 336 個上調基因（圖 5A）。GO富集分析表明，下調基因富集于有絲分裂相關的生物學過程，包括細胞分裂、有絲分裂核分裂和有絲分裂中心體分離的調節(jié)。由于 MDSCs 被認為是相對不成熟的骨髓細胞，這些結果可能表明Mir4435-2hg -/-小鼠中的中性粒細胞成熟過程紊亂，這為理解Mir4435-2hg -/-小鼠中中性粒細胞的下降和 PMN-MDSCs 的升高提供了另一個視角。

大多數(shù)與膽固醇生物合成過程相關的上調基因（圖5B）和 GSEA 也表明這些基因富含膽固醇穩(wěn)態(tài)和脂肪酸代謝（圖 5C和D）。因為脂質積累是 PMN-MDSCs 免疫抑制功能的關鍵調節(jié)因子，作者推測較高的脂質積累導致 PMN-MDSCs 在Mir4435-2hg -/-小鼠中的免疫抑制作用更強。通過 BODIPY 脂質染色，作者觀察到來自無腫瘤Mir4435-2hg的中性粒細胞中脂質積累的增加趨勢-/-小鼠，雖然差異不顯著。然而，來自攜帶腫瘤的Mir4435-2hg -/-小鼠脾臟的 PMN-MDSCs比 WT 小鼠具有更多的脂質（圖 5E和F）。與此一致，體外由CT26和MC38誘導的Mir4435-2hg -/-小鼠BM衍生的PMN- MDSC具有比WT小鼠更多的脂質（圖5G）。Mir4435-2hg -/-小鼠衍生的 PMN-MDSCs 表達更高的Arg1、Nos2、Cox2和 ROS（圖 5H-K)，對T細胞增殖有更強的抑制作用(圖5L)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明Mir4435-2hg的缺失增強了 PMN-MDSC 的免疫抑制能力。

圖5 Mir4435-2hg 的缺失增強了 PMN-MDSCs 的免疫抑制潛力

6. Mir4435-2hg的中性粒細胞特異性缺失促進結直腸癌進展

為了進一步證實中性粒細胞中Mir4435-2hg的消耗，而不是腸上皮細胞中的消耗，導致了在小鼠模型中觀察到的表型，作者生成了條件性敲除Mir4435-2hg flox/flox小鼠，并將它們與 S100a8-Cre 小鼠或 Villin-Cre 雜交小鼠構建中性粒細胞或腸特異性Mir4435-2hg缺失小鼠（圖 6A）。外周血中白細胞的流式細胞術分析顯示，與Mir4435-2hg flox/flox 和 Mir4435-2hg flox/flox 相比，Mir4435-2hg flox / flox S100a8 -Cre 小鼠的中性粒細胞減少Villin-Cre 小鼠，嗜酸性粒細胞的數(shù)量在Mir4435-2hg flox/flox S100a8-Cre 小鼠中也顯著減少。皮下腫瘤模型顯示，Mir4435-2hg flox/flox S100a8-Cre 小鼠的腫瘤生長速度明顯快于對照小鼠（圖 6B），并且在中性粒細胞缺陷型小鼠中腫瘤體積和重量（圖 6C和D）顯著增加Mir4435-2hg小鼠。與Mir4435-2hg -/-小鼠一致，作者發(fā)現(xiàn)來自攜帶腫瘤的Mir4435-2hg flox/flox S100a8-Cre 小鼠的 PMN-MDSCs 中有更高的脂質積累（圖 6E），以及在體外由 MC38 培養(yǎng)基誘導的 BM 衍生的 PMN-MDSCs (圖 6F )。

在AOM/DSS模型中，Mir4435-2hg flox/flox S100a8-Cre 小鼠比Mir4435-2hg flox/flox Villin-Cre 和Mir4435-2hg flox/flox小鼠產(chǎn)生更多和更大的腫瘤（圖 6G） . 雖然Mir4435-2hg flox/flox S100a8-Cre 小鼠的腫瘤計數(shù)沒有顯著增加（圖 6H ），但Mir4435-2hg flox/flox S100a8的平均腫瘤大小和腫瘤負荷（圖 6I和J）顯著增加-Cre 老鼠。在Mir4435-2hg之間未觀察到腫瘤計數(shù)、腫瘤大小或腫瘤負荷的明顯變化flox/flox Villin-Cre 小鼠和Mir4435-2hg flox/flox小鼠。作者還觀察到，與Mir4435-2hg flox/flox Villin-Cre 小鼠和 Mir4435-2hg flox/flox 小鼠相比，Mir4435-2hg flox / flox S100a8 - Cre小鼠中更多的腫瘤浸潤性 PMN-MDSCs 和更少的 CD8 + T 細胞（圖 6K）。總體而言，中性粒細胞/PMN-MDSCs 中Mir4435-2hg的缺失促進了結直腸癌的進展，但腸上皮細胞中沒有。

圖6 中性粒細胞特異性Mir4435-2hg缺失促進結直腸癌進展

結論：

該研究證明了MIR4435-2HG使用多個小鼠模型的意外作用。它通過重塑免疫微環(huán)境而不是作為腫瘤細胞中的癌基因發(fā)揮腫瘤基質中的腫瘤抑制因子的作用。MIR4435-2HG的缺乏增加了腫瘤浸潤性PMN-MDSCs，增強了它們促進結直腸癌發(fā)展的免疫抑制潛力，進一步闡明了結直腸癌發(fā)病機制背后的機制，并提供了潛在的抗腫瘤免疫治療靶點。

參考文獻：

Yu H, Chen C, Han F, Tang J, Deng M, Niu Y, Lai M, Zhang H. Long Noncoding RNA MIR4435-2HG Suppresses Colorectal Cancer Initiation and Progression By Reprogramming Neutrophils. Cancer Immunol Res. 2022 Sep 1;10(9):1095-1110. doi: 10.1158/2326-6066.CIR-21-1011. PMID: 35862232.