線粒體聯(lián)動鐵死亡保衛(wèi)心臟的新策略

細(xì)胞鐵死亡是由鐵依賴性脂質(zhì)過氧化作用驅(qū)動的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡的一種形式。線粒體在細(xì)胞鐵死亡中發(fā)揮著重要的作用，也與一系列疾病顯著相關(guān)。線粒體GSH（mitoGSH）庫的過度耗竭或氧化關(guān)聯(lián)到多種病理生理條件。本研究發(fā)現(xiàn)FUNDC2通過調(diào)控mitoGSH來調(diào)節(jié)鐵死亡應(yīng)激。研究強(qiáng)調(diào)通過阻斷鐵死亡和改善mitoGSH庫和功能來保護(hù)DOX誘導(dǎo)的心肌病。這可能成為一種保護(hù)心臟的新策略。本研究于2022年9月發(fā)表在《PNAS》IF：12.779期刊上。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、敲除FUNDC2可改善阿霉素（DOX）誘導(dǎo)的心肌病

作者首先通過WB分析篩選主要器官中FUNDC2的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)FUNDC2在心臟中高表達(dá)，暗示它的潛在功能（圖1A）。也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)個體完全丟失FUNDC2蛋白后（圖1B），其后代的表型符合孟德爾定理而且正常生長。另外，FUNDC2敲除（FUNDC2-KO）的成年小鼠擁有正常的體重和健康的心臟功能（圖1C-G）。接著作者給野生型小鼠和FUNDC2-KO小鼠分別注射一劑10 mg/kg DOX（生理鹽水作為對照），結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，F(xiàn)UNDC2-KO小鼠的體重和心臟重量顯著顯著減少（圖1C）。經(jīng)胸壁超聲心動圖通過測量左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室縮短率（LVFS）用來評估心臟功能（圖1D）。注射生理鹽水出的WT型小鼠和FUNDC2-KO小鼠在LVEP和LVFS上均沒有明顯的變化，但是與空白對照WT型小鼠相比，用DOX處理過FUNDC2-KO小鼠的心臟功能被保護(hù)地更好（圖1E）。用DOX處理WT小鼠的心房利鈉肽（Anp）、腦鈉肽（Bnp）、肌球蛋白7（Myh7）等生物標(biāo)志物的mRNA水平都顯著上調(diào)，而鹽處理組沒有差異（圖1F）。這些心力衰竭生物標(biāo)志物的mRNA水平也支持這一觀點。Masson ' s Trichrome染色表明FUNDC2的敲除可以防止DOX誘導(dǎo)的心臟纖維化（圖1G）。這些結(jié)果表明喪失FUNDC2保護(hù)小鼠免受DOX誘導(dǎo)的心肌病。

圖1敲除FUNDC2可改善DOX誘導(dǎo)的心肌病

2、敲除FUNDC2可改善DOX誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡

作者推測FUNDC2通過調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵死亡影響DOX誘導(dǎo)的心臟中毒。作者首先驗證Fer - 1預(yù)處理對WT和FUNDC2-KO兩種小鼠心臟損傷都有很強(qiáng)的保護(hù)作用（圖1C-G）。接著進(jìn)一步探索FUNDC2在DOX誘導(dǎo)的鐵死亡中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DOX誘導(dǎo)WT小鼠心臟的Ptgs2 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)近3倍，而Fer - 1預(yù)處理后上調(diào)作用被抑制（圖2A）。然而，在KO小鼠中沒有觀察到Ptgs2 mRNA表達(dá)的變化（圖2A）。

作者進(jìn)一步檢測脂質(zhì)過氧化的生物標(biāo)志物，4 - 羥基壬烯醛（4-HNE）的水平，這也是體內(nèi)鐵死亡的關(guān)鍵指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 - HNE水平在DOX處理的WT小鼠心臟組織中顯著增加（圖2B-C），但在FUNDC2 - KO小鼠中沒有。作者還分析脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的水平，發(fā)現(xiàn)其上調(diào)只能在WT小鼠中檢測到，而在FUNDC2 - KO小鼠中檢測不到（圖2D，左）。作者隨后分離心臟組織的亞細(xì)胞組分，發(fā)現(xiàn)DOX處理增強(qiáng)線粒體中的MDA水平，但不在細(xì)胞質(zhì)中（圖2D，中間，右）。值得注意的是，MDA只在野生型小鼠中增加，不在FUNDC2 - KO小鼠中增加（圖2D，中間，右）。作者的結(jié)果與DOX處理特異性增強(qiáng)線粒體脂質(zhì)過氧化的觀察一致。相反，F(xiàn)UNDC2缺失可以阻止DOX誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化增加。作者進(jìn)一步使用電子顯微鏡檢查線粒體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)DOX處理心臟中的線粒體破裂，嵴扭曲，嵴密度降低（圖2E）。相比之下，F(xiàn)UNDC2的缺失在很大程度上阻止這種線粒體損傷。最后，F(xiàn)er - 1強(qiáng)烈抑制DOX誘導(dǎo)的線粒體變形，暗示DOX -線粒體-鐵死亡信號軸。

圖2敲除FUNDC2緩和DOX誘導(dǎo)的鐵死亡。

3、FUNDC2 - KO抑制Erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡

GSH代謝處于氧化還原代謝和鐵死亡的中心。作者檢測心臟組織中總GSH / 谷胱甘肽二硫化物（GSSG）比值和GSH水平，發(fā)現(xiàn)FUNDC2 - KO心肌中GSH / GSSG比值和GSH水平遠(yuǎn)高于WT組（圖3A）。由于FUNDC2是一種線粒體蛋白，作者試圖確定FUNDC2是否調(diào)節(jié)線粒體GSH。事實上，F(xiàn)UNDC2 - KO心臟中線粒體GSH / GSSG比值和GSH水平高于WT組（圖3A）。值得注意的是，在WT心臟中，總的和線粒體的GSH / GSSG比值和GSH水平都被DOX處理降低到50 %，但在KO心臟中保存（圖3A）。這些數(shù)據(jù)表明，在DOX誘導(dǎo)的心臟中毒中，高GSH水平，特別是mitoGSH，可能具有心臟保護(hù)作用。

為進(jìn)一步理解FUNDC2管理mitoGSH的分子機(jī)制，作者用WT和FUNDC2-KO MEF細(xì)胞進(jìn)行體外研究。與體內(nèi)結(jié)果一致，F(xiàn)UNDC2 - KO MEF細(xì)胞中線粒體和胞漿GSH / GSSG比值和GSH （cytoGSH）水平顯著高于WT MEF細(xì)胞（圖3B）。Erastin處理降低WT和FUNDC2 - KO MEF細(xì)胞的GSH / GSSG比值和GSH水平，但FUNDC2 - KO MEF細(xì)胞的GSH / GSSG比值和GSH水平在所有條件下均高于WT MEF細(xì)胞（圖3B）。GSH水平與erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡相關(guān)（圖3C），表明GSH在鐵死亡中的功能重要性。使用脂質(zhì)過氧化的熒光探針C11 - BODIPY通過流式細(xì)胞術(shù)檢測脂質(zhì)ROS的積累，證明FUNDC2的缺失阻止erastin誘導(dǎo)的脂質(zhì)ROS積累（圖3D）。DOX誘導(dǎo)的鐵死亡也在MEF細(xì)胞中得到證實。

為進(jìn)一步證實FUNDC2通過mitoGSH促進(jìn)鐵死亡，作者用mitoGSH處理MEF細(xì)胞，并用一種特定的mitoGSH消耗化學(xué)物質(zhì)mitoCDNB選擇性損耗mitoGSH。mitoCDNB預(yù)處理降低線粒體GSH / GSSG比值和GSH水平，erastin處理后進(jìn)一步降低（圖3E）。mitoCDNB處理有效增強(qiáng)erastin誘導(dǎo)的WT細(xì)胞和FUNDC2- KO MEF細(xì)胞死亡和脂質(zhì)ROS積累（圖3F-H）。這些結(jié)果表明mitoGSH耗竭確實增加erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

圖3FUNDC2-KO抑制但mitoGSH耗竭增加erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

4、FUNDC2–SLC25A11軸調(diào)節(jié)鐵死亡

作者研究FUNDC2與SLC25A11之間的相互作用是否在鐵死亡中發(fā)揮功能。，作者首先以scramble shRNA作為對照，在WT和FUNDC2 - KO MEF細(xì)胞中穩(wěn)定敲低SLC25A11（圖4A），發(fā)現(xiàn)SLC25A11缺失降低WT和FUNDC2 - KO MEF細(xì)胞中線粒體GSH / GSSG比率和GSH水平，而對胞漿GSH / GSSG比率和GSH水平無明顯影響（圖4B）。SLC25A11 KD也增強(qiáng)erastin誘導(dǎo)的鐵死亡，無論FUNDC2水平如何，細(xì)胞活力，細(xì)胞死亡（圖4C-E）和脂質(zhì)ROS積累都證明了這一點（圖4F）。這些數(shù)據(jù)表明SLC25A11對于細(xì)胞抵抗鐵死亡是必需的。

作者進(jìn)一步探索在SLC25A11中獲得功能是否可以防止erastin誘導(dǎo)的鐵死亡。將編碼載體或Flag - SLC25A11的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到WT和FUNDC2 - KO MEF細(xì)胞中（圖4G），發(fā)現(xiàn)在WT和FUNDC2 - KO MEF細(xì)胞中，無論是否用erastin處理，SLC25A11過表達(dá)均增加線粒體GSH / GSSG比值和GSH水平（圖4H）。因此，過表達(dá)SLC25A11足以抑制erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（圖4I-K）和脂質(zhì)ROS積累（圖4L）。這些結(jié)果表明SLC25A11可以對抗FUNDC2依賴性的鐵死亡。

圖4 FUNDC2–SLC25A11軸調(diào)節(jié)鐵死亡

5、FUNDC2調(diào)節(jié)SLC25A11的穩(wěn)定性

在這里作者探究FUNDC2如何調(diào)控SLC25A11。通過WB檢測，作者發(fā)現(xiàn)FUNDC2-KO可以增加SLC25A11水平，并阻斷erastin誘導(dǎo)的GPX4和線粒體蛋白如TIM23和TOM20在MEF細(xì)胞中的減少（圖5A）。此外，F(xiàn)UNDC2 - KO小鼠心臟組織中SLC25A11水平高于WT小鼠（圖5B）。沒有觀察到SLC25A10的影響，另一個SLC25家族成員（圖5A-B）。盡管在WT和FUNDC2 - KO小鼠中，線粒體蛋白和GPX4在響應(yīng)DOX時均下調(diào)，但FUNDC2 - KO緩解下調(diào)的程度（圖5B）。然后作者測試在鐵死亡過程中FUNDC2和SLC25A11之間的相互作用是否增強(qiáng)。通過免疫共沉淀實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)erastin處理增強(qiáng)FUNDC2和SLC25A11之間的相互作用（圖5C）。類似的結(jié)果在體內(nèi)心臟組織中得到重現(xiàn)（圖5D）。

因為許多線粒體蛋白需要組裝成寡聚體結(jié)構(gòu)才發(fā)揮其功能，作者通過凝膠電泳檢測SLC25A11的寡聚體狀態(tài)。如圖5E所示，在MEF細(xì)胞中，用溫和的非變性洗滌劑Nonident P - 40裂解線粒體時，SLC25A11蛋白以二聚體形式存在；而在強(qiáng)變性洗滌劑十二烷基硫酸鈉（SDS）裂解時，只能觀察到SLC25A11的單體形式。無論erastin處理與否，F(xiàn)UNDC2-KO MEF細(xì)胞中SLC25A11的二聚體和單體蛋白水平均高于WT MEF細(xì)胞（圖5E）。同樣，在心臟組織和它們在體內(nèi)的線粒體部分中也可以觀察到差異，盡管程度相對較?。▓D5F）。這些結(jié)果表明FUNDC2通過調(diào)節(jié)SLC25A11的穩(wěn)定性和二聚化來調(diào)節(jié)其功能。

圖5 FUNDC2調(diào)控SLC25A11蛋白

結(jié)論

本研究結(jié)果表明線粒體FUNDC2對于DOX誘導(dǎo)的心肌病是重要的。敲除FUNDC2在很大程度上預(yù)防DOX誘導(dǎo)的心肌病。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UNDC2調(diào)控mitoGSH以及DOX誘導(dǎo)的鐵死亡和心臟損傷需要穩(wěn)定的GPX4和SLC25A11。也說明線粒體定位的GPX4抑制脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)生，并防止DOX誘導(dǎo)的鐵死亡。本研究強(qiáng)調(diào)通過阻斷鐵死亡和改善mitoGSH庫和功能來保護(hù)DOX誘導(dǎo)的心肌病的策略。

參考文獻(xiàn)

Ta N, Qu C, Wu H, Zhang D, Sun T, Li Y, Wang J, Wang X, Tang T, Chen Q, Liu L. (2022). Mitochondrial outer membrane protein FUNDC2 promotes ferroptosis and contributes to doxorubicin-induced cardiomyopathy. Proc Natl Acad Sci USA. 119(36):e2117396119. doi: 10.1073/pnas.2117396119.