踏上circRNA的潮流，探索骨肉瘤的新型治療措施

環(huán)狀RNA（circRNA）是一類特殊的非編碼RNA分子，在許多疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。而難治性轉(zhuǎn)移性骨肉瘤（OS）標(biāo)準(zhǔn)治療的臨床療效不理想，新興的抗血管生成方案仍處于嬰兒期。本研究發(fā)現(xiàn)circFIRRE是OS腫瘤發(fā)生和血管生成的主要調(diào)控因子，并從體外和體內(nèi)初步驗(yàn)證YY1-circFIRRE-miR-486-3p / miR-1225-5p-LUZP1通路在OS中的調(diào)控作用。這些結(jié)果提示circFIRRE能夠作為一種新的預(yù)后生物標(biāo)志物和難治性O(shè)S的治療靶點(diǎn)。本研究于2022年8月發(fā)表在《Molecular Cancer》IF：41.444的期刊上。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1.      circFIRRE在OS樣品和細(xì)胞中的篩選和表征

作者通過(guò)rRNA-depleted RNA-seq分析四對(duì)OS組織和正常相鄰樣本的circRNA表達(dá)圖譜。表達(dá)異常的circRNA以火山圖的形式展現(xiàn)在圖1A中。作者選出前五個(gè)表達(dá)上調(diào)的circRNA，分別是circRUNX2（hsa_circ_0003563）、circSATB2（hsa_circ_0003915）、circFIRRE（hsa_circ_0001944）、circAFF2（hsa_circ_0001947）和circBBS9（hsa_circ_0003162）。然后開(kāi)展對(duì)16對(duì)樣本中的這五種異常表達(dá)的circRNA進(jìn)行RT-qPCR分析工作。結(jié)果發(fā)現(xiàn)circFIRRE因OS組織和鄰近的組織差異最大而差異表達(dá)最顯著（圖1B）。擴(kuò)大樣本量至104對(duì)匹配的臨床OS樣本和鄰近正常樣本，RT-qPCR分析結(jié)果顯示，circFIRRE表達(dá)顯著上調(diào)（圖1C）。另外，F(xiàn)ISH實(shí)驗(yàn)使用五對(duì)新鮮的患者樣本也證實(shí)了上調(diào)趨勢(shì)（圖1D）。與成骨細(xì)胞系（hFOB1.19）相比，143B、SJSA-1、HOS、U2OS和MG63這五個(gè)細(xì)胞系的circRNA表達(dá)顯著上調(diào)，特別是U2OS和MG63（圖1E）。circFIRRE的亞細(xì)胞定位在細(xì)胞功能中是很重要的。作者經(jīng)過(guò)核質(zhì)分離后的RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中circFIRRE表達(dá)在U2OS和MG63細(xì)胞中也顯著上調(diào)（圖1F-G），RNA FISH實(shí)驗(yàn)表明circFIRRE約有80%在細(xì)胞質(zhì)中，20%在細(xì)胞核中（圖1H）。circFIRRE的確切大小為1096 bp，其特異的反式剪接被Sanger測(cè)序證實(shí)（圖1I）。用放線菌素D處理MG63和U2OS細(xì)胞后檢測(cè)circFIRRE的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)其可以在轉(zhuǎn)錄上抑制RNA合成，circFIRRE的半衰期大于24小時(shí)，比linearFIRRE在轉(zhuǎn)錄上更穩(wěn)定，linear FIRRE的半衰期小于5 h（圖1J-K），circFIRRE能抵抗RNase R酶的消化，而FIRRE在處理后很容易降解（圖1L-O）。這些結(jié)果提示circFIRRE可以在OS細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，也可能成為診斷或預(yù)后預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物。

考慮到反剪接可能來(lái)自反式剪接或基因組重排，因而采用瓊脂糖凝膠電泳（AGE）排除基因組重排的可能性。circFIRRE和linearFIRRE分別用發(fā)散引物和收斂引物在OS細(xì)胞的cDNA和基因組DNA提取物中擴(kuò)增。AGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)circFIRRE只存在于cDNA中，而不存在于基因組DNA中（圖1P-Q）。

圖1 識(shí)別和驗(yàn)證OS組織和細(xì)胞中下調(diào)的circFIRRE。

2.      circRNA上調(diào)預(yù)示OS病人的腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)更大和不良預(yù)后

為評(píng)估總生存期（OAS）和無(wú)病生存期（DFS）的危險(xiǎn)因素，作者進(jìn)行采單因素和多因素分析。單因素分析顯示，年齡、手術(shù)方式、腫瘤轉(zhuǎn)移和circFIRRE高表達(dá)與OAS和DFS相關(guān)。在這些變量中，多因素分析顯示年齡、手術(shù)方式、circFIRRE轉(zhuǎn)移和表達(dá)升高是OS患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（圖2A-D）。此外，Kaplan-Meier生存曲線顯示circFIRRE高表達(dá)組的OAS和DFS比circFIRRE低表達(dá)組更低（圖2E-F）。circFIRRE的高表達(dá)水平與較短的生存期、較差的臨床結(jié)果和較高的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈正相關(guān)（圖2G）。以上結(jié)果說(shuō)明circFIRRE可作為OS患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，參與OS的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。 

圖2 確定circFIRRE作為預(yù)測(cè)OS預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

3.      circFIRRE促進(jìn)體外OS的進(jìn)展

為調(diào)查OS的生物狀態(tài)的標(biāo)志，作者們展開(kāi)特征基因集的GSEA分析。在MG63和U2OS中建立circFIRRE穩(wěn)定敲除細(xì)胞系（圖3A）。然后，作者們執(zhí)行CCK8和EdU檢測(cè)OS細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照細(xì)胞相比，sh-circFIRRE細(xì)胞增殖及EdU結(jié)合顯著降低（圖3B-F）。Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，circFIRRE下調(diào)降低OS細(xì)胞遷移和侵襲的能力（圖3G-I）。流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)sh-circFIRRE細(xì)胞被阻滯在G0/G1期，表明circFIRRE敲低可促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯。這些說(shuō)明circFIRRE敲低體外抑制OS腫瘤生長(zhǎng)和活性。RT-qPCR驗(yàn)證過(guò)表達(dá)效率，并證實(shí)轉(zhuǎn)染不影響linearFIRRE表達(dá)（圖3J）。CCK8和EdU分析顯示circFIRRE過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)MG63和U2OS增殖（圖3K-O）。這些說(shuō)明circFIRRE參與體外OS的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。

圖3 體外circFIRRE影響OS的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。

4.      circFIRRE誘導(dǎo)血管生成

作者推測(cè)circFIRRE在OS肺轉(zhuǎn)移中可能參與血管生成。為驗(yàn)證猜想，作者對(duì)轉(zhuǎn)移性O(shè)S組織內(nèi)皮細(xì)胞中circFIRRE是否富集進(jìn)行研究。作者們從局限性骨肉瘤患者和三個(gè)臨床轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者的樣本中獲得原發(fā)性內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)CD31+磁珠分選，檢測(cè)circFIRRE在內(nèi)皮細(xì)胞中的差異表達(dá)（圖4A）。RT-qPCR分析顯示，相對(duì)于非轉(zhuǎn)移性O(shè)S中的內(nèi)皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)移性O(shè)S中的circFIRRE顯著上調(diào)（圖4B），揭示其在血管生成和OS轉(zhuǎn)移中的潛在作用。三種常見(jiàn)的內(nèi)皮細(xì)胞系（HUVEC，EA.hy926，hmec1），HUVEC細(xì)胞circFIRRE表達(dá)水平最高。因此，作者選擇HUVEC進(jìn)行血管生成研究。將三個(gè)circFIRRE靶向siRNAs轉(zhuǎn)入HUVEC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)si-1和si-2具有較好的敲低效果，降低50%以上的circFIRRE表達(dá)水平（圖4D）。si-1和si-2將用作后面的功能實(shí)驗(yàn)。tube formation assay再次驗(yàn)證，與對(duì)照組相比，si-circFIRRE顯著降低HUVEC細(xì)胞的增殖、遷移和管形成能力（圖4E-F）。主動(dòng)脈環(huán)檢測(cè)顯示，si-circFIRRE轉(zhuǎn)染的主動(dòng)脈環(huán)在膠原中包埋7天，微血管面積較正常組小（圖4G）。CAM是一種血管高度分化的雞胚外膜，si-circFIRRE共孵育后新形成的血管明顯受損（圖4H）。這些結(jié)果表明circFIRRE下調(diào)顯著抑制血管生成。對(duì)新芽進(jìn)行tube formation assay，結(jié)果顯示circFIRRE過(guò)表達(dá)顯著增加HUVEC細(xì)胞的分支點(diǎn)和毛細(xì)血管長(zhǎng)度（圖4I-J）。CAM和主動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)表明circFIRRE也能促進(jìn)血管生成（圖4K-L）。上述這些結(jié)果說(shuō)明circFIRRE可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)的新生血管形成。

圖4 circFIRRE誘導(dǎo)體內(nèi)、體外腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)的新生血管形成。

5.      YY1調(diào)控OS中circFIRRE的表達(dá)

鑒于circFIRRE在OS中顯著上調(diào)，作者們假設(shè)circFIRRE在人類OS發(fā)育中受上游轉(zhuǎn)錄因子（TF）調(diào)控。作者從UCUS基因?yàn)g覽器中檢索到FIRRE的啟動(dòng)子，用三種算法來(lái)預(yù)測(cè)能與啟動(dòng)子結(jié)合的潛在的TFs，發(fā)現(xiàn)Yin Yang 1（YY1）是這些算法中唯一的轉(zhuǎn)錄因子（圖5A）。然后檢測(cè)了35對(duì)OS樣本中YY1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于相鄰的正常對(duì)照，circFIRRE在OS樣本中高表達(dá)，并且與circFIRRE的表達(dá)水平呈正相關(guān)（圖5B-C）。在細(xì)胞水平上，相比于hFOB1.19細(xì)胞，MG63和U2OS細(xì)胞YY1表達(dá)相對(duì)上調(diào)（圖5D）。隨后，作者將circFIRE的啟動(dòng)子序列與JASPAR中的YY1結(jié)合基序進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)circFIRE啟動(dòng)子中2個(gè)可能的YY1結(jié)合位點(diǎn)（圖5E），并利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了2個(gè)可能的結(jié)合位點(diǎn)。在野生型（WT）組中，過(guò)表達(dá)YY1后，circFIRRE啟動(dòng)子的熒光素酶活性增強(qiáng)，而結(jié)合位點(diǎn)1或2的突變部分挽救了這種增強(qiáng)效應(yīng)，而同時(shí)突變結(jié)合位點(diǎn)1和2時(shí)，熒光素酶活性沒(méi)有顯著變化（圖5F）。為探究YY1對(duì)circFIRRE和linearFIRRE表達(dá)變化的影響，作者設(shè)計(jì)了3條YY1的siRNA，并選擇敲低效果較好的si-YY1-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖5G）。YY1敲低后，circFIRRE在MG63和U2OS中的表達(dá)顯著下調(diào)，而線性FIRRE表達(dá)下調(diào)幅度最小，說(shuō)明兩組間無(wú)顯著性差異（圖5H-I），YY1過(guò)表達(dá)是相反的結(jié)果（圖5J-L）。這些結(jié)果表明YY1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用很可能主要是針對(duì)circFIRRE，而不是對(duì)線性FIRRE的調(diào)控。即：YY1可能是OS中circFIRRE轉(zhuǎn)錄的激活因子。

圖5 YY1激活circFIRRE轉(zhuǎn)錄。

6.      circFIRRE在OS細(xì)胞中海綿miR-486-3p和miR-1225-5p

鑒于circFIRRE主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，作者推測(cè)circFIRRE可能作為miRNA海綿中和miRNA介導(dǎo)的基因沉默。首先，針對(duì)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）的核心成分AGO2（氬氣RISC催化組件2）蛋白進(jìn)行RNA免疫沉淀。結(jié)果顯示，circFIRRE被AGO2 pull down特異性富集，而非免疫球蛋白G（IgG）（圖6A-C），提示circFIRRE可能與RISC結(jié)合并海綿化相應(yīng)的miRNA。然后應(yīng)用了五種算法預(yù)測(cè)circFIRE的潛在靶miRNA，并從數(shù)據(jù)庫(kù)間的重疊中確定miR-486-3p和miR-1225-5p為候選miRNA（圖6D）。RT-qPCR檢測(cè)circFIRRE對(duì)miR-486-3p和miR-1225-5p表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明，這兩個(gè)miRNAs在35個(gè)配對(duì)的OS樣本和細(xì)胞系中相對(duì)于鄰近的正常對(duì)照和成骨細(xì)胞的表達(dá)顯著下調(diào)（圖6E），并且與circFIRRE表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖6H-I）。FISH實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這種模式（圖6F-G）。然后，通過(guò)circFIRRE敲低（si-circFIRRE-1）顯著上調(diào)miR-486-3p和miR-1225-5p的表達(dá)水平，反之下調(diào)miR-486-3p和miR-1225-5p的表達(dá)水平（圖6J-K）。這些結(jié)果表明miR-486-3p和miR-1225-5p在OS中相對(duì)低表達(dá)，并受circFIRRE的負(fù)調(diào)控。

此外，利用特異性生物素標(biāo)記的circFIRRE探針，通過(guò)pull-down實(shí)驗(yàn)研究circFIRRE是否可以直接結(jié)合這兩個(gè)miRNAs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于寡核苷酸探針，circFIRRE探針能夠特異性富集細(xì)胞裂解液中的circFIRRE、miR-486-3p和miR-1225-5p（圖6L-M）。pull-down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，與對(duì)照探針相比，特異性生物素標(biāo)記的miR-486-3p和miR-1225-5p探針成功捕獲circFIRRE（圖6N-O）。將熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒與miR-486-3p或miR-1225-5p mimic共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照miRNA相比，miR-486-3p和miR-1225-5p協(xié)同將熒光素酶活性至少降低50%。隨后從熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒中突變預(yù)測(cè)的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)miRNA轉(zhuǎn)染后突變的熒光素酶活性保持不變（圖6P）。在MG63和U2OS細(xì)胞中，circFIRRE與相應(yīng)的miRNAs通過(guò)雙重FISH實(shí)驗(yàn)共定位，支持了上述結(jié)果（圖6Q-R）。所有這些發(fā)現(xiàn)表明circFIRRE可能作為miR-486-3p和miR-1225-5p的海綿發(fā)揮作用。

圖6 circFIRRE充當(dāng)miR-486-3p和miR-1225-5p的海綿。

7.        體外circFIRRE通過(guò)miR-486-3p和miR-1225-5p-LUZP1軸促進(jìn)骨肉瘤發(fā)生和新生血管形成

基于以前的研究，作者推測(cè)circFIRRE可能通過(guò)抑制兩種miRNA的保護(hù)作用，激活下游基因，促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展和新生血管形成。作者首先尋找miR-486-3p和miR-1225-5p在OS中的靶基因。通過(guò)3種預(yù)測(cè)算法（miRDB、TargetScan和RNAInter）和RNA-seq數(shù)據(jù)交叉分析，發(fā)現(xiàn)LUZP1（亮氨酸拉鏈蛋白1）是重疊基因中唯一的預(yù)測(cè)基因（圖7A）。RT-qPCR驗(yàn)證正常鄰近樣本相比，LUZP1在35對(duì)臨床OS樣本中上調(diào)（圖7B），發(fā)現(xiàn)它們與miR-486-3p和miR-1225-5p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與circFIRRE呈正相關(guān)（圖7C-E）。作者將熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒與miR-486-3p和miR-1225-5p mimic共轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞，研究這兩個(gè)miRNAs與LUZP1之間的相互作用。LUZP1 3′-UTR降低的熒光素酶活性伴隨著miRNA的過(guò)表達(dá)。相反，與LUZP1 3′-UTR突變后的對(duì)照相比，熒光素酶活性保持不變（圖7F）。研究采用RT-qPCR和Western blot進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，si-circFIRRE-1引起的內(nèi)源性LUZP1下調(diào)在mRNA和蛋白水平被miR-486-3p或miR-1225-5p抑制劑部分挽救（圖7G-H）。Wound healing assay和Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)表明，miR-486-3p和miR-1225-5p抑制劑明顯消除對(duì)sh-circFIRRE-1細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用（圖7I-J）。此外，tube formation assay顯示miR-486-3p和miR-1225-5p抑制劑明顯增加了si-circFIRRE-1細(xì)胞中減少的分支點(diǎn)和毛細(xì)血管長(zhǎng)度（圖7K-L）?？傊@些發(fā)現(xiàn)表明circFIRRE在體外至少部分通過(guò)miR-486-3p / miR-1225-5p-LUZP1通路促進(jìn)OS進(jìn)展和新生血管形成。

圖7 體外circFIRRE通過(guò)miR-486-3p和miR-1225-5p-LUZP1軸促進(jìn)骨肉瘤發(fā)生和新生血管形成。

8.      circFIRRE通過(guò)海綿化miRNA促進(jìn)OS腫瘤的原位發(fā)生和體內(nèi)轉(zhuǎn)移

為驗(yàn)證circFIRRE-miR-486-3p / miR-1225-5p軸在體內(nèi)的功能，研究構(gòu)建原位異種移植瘤模型和尾靜脈轉(zhuǎn)移模型。將熒光染料標(biāo)記的MG63細(xì)胞注入右脛骨骨髓腔，建立原位異種移植瘤模型（每組10個(gè)）。熒光素酶強(qiáng)度顯示circFIRRE敲低明顯降低原位腫瘤大小，抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，而miR-486-3p和miR-1225-5p抑制減輕這種損傷（圖8A）。在注射后5周進(jìn)行micro-CT掃描和三維重建以評(píng)估腫瘤發(fā)生引起的骨破壞情況。結(jié)果表明，對(duì)照組出現(xiàn)嚴(yán)重的脛腓骨和關(guān)節(jié)破壞，sh-circFIRRE組骨破壞減輕，而miR-486-3p和miR-1225-5p海綿拯救了sh-circFIRRE的修復(fù)（圖8B）。注射后5周，處死小鼠，獲取OS病灶進(jìn)行免疫組化（IHC）和蛋白分析。IHC結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖標(biāo)志物ki-67顯示腫瘤增殖活性減弱，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和顯示EMT能力受到抑制。在shcircFIRRE-1組中Vimentin和上皮標(biāo)志物E-cadherin，而這些腫瘤特征被miRNA海綿拯救（圖8C）。在sh-circFIRRE-1組中觀察到LUZP1的蛋白水平相對(duì)于對(duì)照組下調(diào)，而在IHC和Western bolt分析中抑制miR-486-3p和miR-1225-5p部分消除了下調(diào)（圖8D-E）。

為了進(jìn)一步研究circFIRRE如何調(diào)節(jié)腫瘤肺轉(zhuǎn)移和血管生成，作者通過(guò)將穩(wěn)定的熒光素酶標(biāo)記的MG63細(xì)胞注射到裸鼠的側(cè)尾靜脈中（每組10只小鼠），構(gòu)建肺轉(zhuǎn)移模型。注射后4周，根據(jù)IVIS實(shí)驗(yàn)中熒光素酶的強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠肺野內(nèi)有彌漫性轉(zhuǎn)移；sh-circFIRRE組的肺區(qū)相對(duì)清晰，無(wú)廣泛轉(zhuǎn)移；與sh-circFIRRE組相比，沉默miR-486-3p和miR-1225-5p顯著增加了肺轉(zhuǎn)移的程度和轉(zhuǎn)移病灶的大小（圖8F）。同樣，micro -CT掃描和三維重建顯示，與對(duì)照組相比，sh-circFIRRE組的腫瘤體積和數(shù)量顯著減少（圖8G-I），而與sh-circFIRRE組相比，sh-circFIRRE和miRNAs海綿組的轉(zhuǎn)移病灶體積和數(shù)量增加。切除的肺在光照和蘇木精和伊紅染色下的照片進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)論（圖8J-K）。轉(zhuǎn)移OS中VEGF和CD31染色顯示，對(duì)照組和miRNAs海綿組的血管生成均被顯著激活，而在sh-circFIRRE-1組中血管生成被抑制（圖8L-M）。IHC和Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)移灶中LUZP1表達(dá)的相應(yīng)變化（圖8N-O）。所有這些發(fā)現(xiàn)表明circFIRRE通過(guò)在體內(nèi)吸附miR-486-3p / miR-1225-5p促進(jìn)骨肉瘤的原位生長(zhǎng)、肺轉(zhuǎn)移和血管生成。

圖8 circFIRRE通過(guò)海綿化miRNAs促進(jìn)OS腫瘤的原位發(fā)生和體內(nèi)轉(zhuǎn)移。

結(jié)論

總之，與相鄰的正常樣本相比，OS患者樣本中circFIRRE表達(dá)上調(diào)。circFIRRE表達(dá)升高與不良臨床表現(xiàn)呈正相關(guān)。體外和體內(nèi)初步驗(yàn)證了YY1-circFIRRE-miR-486-3p/ miR-1225-5p-LUZP1通路在OS中的調(diào)控作用。研究首次闡明circFIRRE在OS腫瘤發(fā)生和血管生成中的作用，可能為難治性O(shè)S等腫瘤中circRNAs的分子生物學(xué)、診斷和治療研究提供有用的參考。

參考文獻(xiàn)

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