鐵死亡抑制劑治療原發(fā)性卵巢功能不全

原發(fā)性卵巢功能不全（POI）是一種以原始卵泡過早衰竭為特征的卵巢功能障礙的臨床綜合征。POI能引起不孕不育、嚴(yán)重的日常生活紊亂和長期的健康風(fēng)險(xiǎn)。然而，POI的潛在機(jī)制在很大程度上仍不清楚。本文揭示了基于BNC1缺陷的POI的病理機(jī)制，提示YAP和鐵死亡抑制劑在POI治療中的潛在價(jià)值。本文于2022年10月發(fā)表在《Nature Communications》IF：17.694期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、Bnc1截?cái)嗤蛔儗?dǎo)致卵泡過度激活和閉鎖

為確定Bnc1突變對(duì)卵泡發(fā)生的影響，從用10 IU孕母馬血清促性腺激素（PMSG）超排卵的4周齡和12周齡小鼠中收集生發(fā)囊（GV）卵母細(xì)胞，比較野生型（Bnc1tr/tr）和Bnc1純合子突變（WT，Bnc1+/+）的卵泡發(fā)生的變化。結(jié)果顯示與WT小鼠比較，Bnc1突變小鼠的卵母細(xì)胞增多，但卵巢反應(yīng)隨年齡的增加而下降（Fig. 1a–b）。作者猜想Bnc1tr/tr小鼠的卵巢儲(chǔ)備也隨著年齡的增長而下降。為驗(yàn)證該猜想，比較WT和Bnc1tr/tr小鼠在出生后1天（PD1）和3, 4, 12, 16周時(shí)的卵泡數(shù)量。結(jié)果顯示，與WT比較，Bnc1tr/tr小鼠的卵泡數(shù)量在PD1時(shí)無差異（Fig. 1c），在3周時(shí)卵泡數(shù)量減少，卵泡過度激活，但未觀察到卵泡閉鎖（Fig. 1d），在4周時(shí)也是（Fig. 1e）。在12和16周時(shí)，表型和4周時(shí)類似，但是還觀察到閉鎖卵泡數(shù)量顯著增加，而原始卵泡耗竭率下降（Fig. 1f, g）?？傊@些數(shù)據(jù)表明，在具有Bnc1突變的小鼠POI模型中，卵泡過度激活（Fig. 1h-i），閉鎖卵泡數(shù)量隨著年齡的增長而增加。

圖1 Bnc1突變影響卵泡發(fā)育

2、條件敲除卵母細(xì)胞中Bnc1可通過卵泡過度激活和卵泡閉鎖誘導(dǎo)POI

采用Fig. 2a的方法構(gòu)建選擇性敲除卵母細(xì)胞Bnc1的小鼠，結(jié)果顯示Bnc1突變小鼠的卵巢重量/體重比和卵巢大小均小于WT小鼠（Fig. 2b），并且突變小鼠都不孕（Fig. 2c）；組織學(xué)和形態(tài)分析顯示Bnc1突變小鼠卵巢卵泡數(shù)量減少（Fig. 2d）；這種表型提示BNC1在卵母細(xì)胞中起作用，并在原始卵泡期起作用。此外，選擇性敲除卵母細(xì)胞Bnc1的小鼠的卵巢動(dòng)態(tài)變化和Bnc1tr/tr小鼠的類似，其卵泡數(shù)量減少，卵泡過度激活和卵泡閉鎖（Fig. 2e-g）。這些數(shù)據(jù)表明，在卵母細(xì)胞特異性敲除Bnc1的小鼠中，卵泡被過度激活，閉鎖卵泡的數(shù)量增加。

圖2 Bnc1通過影響卵母細(xì)胞影響卵泡發(fā)育

3、Bnc1突變通過非凋亡性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)卵泡閉鎖

由于文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞凋亡參與了卵泡閉鎖，所以作者想確定細(xì)胞凋亡是否參與了Bnc1突變小鼠的卵巢卵泡閉鎖。然而，WB結(jié)果顯示W(wǎng)T和Bnc1tr/tr小鼠的卵巢中這些凋亡標(biāo)志物的表達(dá)無差異（Fig. 3a-b）。Annexin V染色也顯示W(wǎng)T小鼠和卵母細(xì)胞特異性敲除Bnc1小鼠在早期的細(xì)胞凋亡方面無差異（Fig. 3c）。類似地，DNA損傷標(biāo)志物也在兩種小鼠間無差異（Fig. 3d）。這些結(jié)果表明Bnc1突變小鼠的卵泡閉鎖不是通過由凋亡介導(dǎo)而是通過非凋亡細(xì)胞死亡通路實(shí)現(xiàn)的。

圖3 Bnc1突變通過非凋亡性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)卵泡閉鎖

4、異常的脂質(zhì)代謝和鐵死亡參與卵泡閉鎖

為揭示Bnc1突變導(dǎo)致卵泡閉鎖的分子機(jī)制，對(duì)卵巢組織進(jìn)行RNA測(cè)序，總計(jì)獲得523個(gè)差異表達(dá)基因（Fig. 4a）。KEGG和GSVA揭示相比于WT小鼠，突變小鼠的卵巢表現(xiàn)出脂質(zhì)代謝紊亂（Fig. 4b, c）。此外，卵母細(xì)胞Smart-seq獲得了類似的結(jié)果，總計(jì)收獲4554個(gè)差異表達(dá)基因（Fig. 4d, e），GO分析提示他們參與異常的線粒體功能和脂質(zhì)代謝受損（Fig. 4f, g），KEGG顯示它們參與Hippo和鐵死亡通路（Fig. 4h, i）。鑒于線粒體介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化是鐵死亡的關(guān)鍵，所以這些結(jié)果提示鐵死亡可能參與Bnc1突變導(dǎo)致的POI進(jìn)展。

圖4 Bnc1突變可能通過鐵死亡誘導(dǎo)卵泡閉鎖

5、Bnc1突變導(dǎo)致的卵泡閉鎖是由鐵死亡介導(dǎo)

為表征Bnc1突變是否導(dǎo)致卵母細(xì)胞鐵死亡，采用透射電鏡和掃描電鏡觀察突變小鼠的GV卵母細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bnc1突變導(dǎo)致過多的脂質(zhì)積累（Fig. 5a）；線粒體分布異常，聚集異常；線粒體膜的密度增加（Fig. 5b）；GV卵母細(xì)胞和小鼠卵巢的尼羅紅染色也證實(shí)了脂質(zhì)積累（Fig. 5c）。此外，選擇性敲除卵母細(xì)胞Bnc1的小鼠和Bnc1tr/tr小鼠的卵母細(xì)胞中ROS和MitoSOX的水平均顯著增加（Fig. 5d, e），且在卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)線粒體分布缺陷，線粒體位于細(xì)胞膜下方（Fig. 5e）。JC-1染色顯示兩種突變鼠卵母細(xì)胞中的線粒體膜電位明顯升高（Fig. 5f）。兩種突變鼠卵母細(xì)胞中的脂質(zhì)ROS產(chǎn)量也顯著增加（Fig. 5g），而GPX4的表達(dá)顯著下降（Fig. 5h, i），Nox1和Cox2的表達(dá)增加，其余鐵死亡標(biāo)志物的表達(dá)也異常改變（Fig. 5j）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。鐵死亡誘導(dǎo)劑RLS3和抑制劑Fer-1可分別顯著增強(qiáng)或抑制Bnc1缺陷誘導(dǎo)的小鼠卵母細(xì)胞脂質(zhì)過氧化（Fig. 5k）。綜上所述，這些結(jié)果表明，卵母細(xì)胞的Bnc1突變和敲除可誘導(dǎo)鐵死亡。

圖5受Bnc1突變影響的卵母細(xì)胞對(duì)鐵死亡更加敏感

6、BNC1缺乏通過NF2-YAP途徑引發(fā)卵母細(xì)胞鐵死亡

為探究Bnc1缺失誘導(dǎo)卵母細(xì)胞鐵死亡的分子機(jī)制，進(jìn)行了ChIP-seq，發(fā)現(xiàn)NF2可能是Bnc1的靶基因。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道敲除NF2和激活Hippo可促進(jìn)鐵死亡。所以作者探究了Bnc1缺失是否通過調(diào)控NF2誘導(dǎo)卵母細(xì)胞鐵死亡。ChIP-qPCR和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)都證實(shí)了Bnc1可與NF2的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合（Fig. 6a, b）。此外，啟動(dòng)子缺失試驗(yàn)確定片段（1-500 bp）是Bnc1調(diào)控Nf2所需的（Fig. 6b）。免疫熒光和免疫組化結(jié)果顯示，相比于WT小鼠卵巢，Bnc1tr/tr小鼠的卵母細(xì)胞中NF2的表達(dá)顯著下降，YAP的核定位及下游基因TFRC和ACSL4的表達(dá)顯著增加（Fig. 6c-g）；Fe2+含量顯著增加（Fig. 6h）。過量鐵依賴的PUFA的過氧化可誘導(dǎo)鐵死亡。靶向脂質(zhì)組學(xué)揭示相比于WT小鼠，Bnc1突變小鼠卵母細(xì)胞中PUFA組分的水平顯著增加，如(PE) (18:1/18:2)，PE (16:0/20:4)，PE (18:2/18:2)，PE (18:1/20:4)，(PS) (14:0/20:4)和(PI)(18:0/18:2)（Fig. 6i）。這些結(jié)果表明，Bnc1靶向NF2介導(dǎo)Hippo-YAP通路，參與鐵死亡的調(diào)控。

圖6 Bnc1截?cái)嗤蛔兺ㄟ^調(diào)節(jié)NF2-YAP信號(hào)使卵母細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感

7、靶向NF2-Hippo/YAP通路挽救Bnc1突變誘導(dǎo)的鐵死亡

為進(jìn)一步探究Bnc1通過調(diào)控NF2介導(dǎo)鐵死亡的分子機(jī)制，將Nf2 mRNA微注射到GV卵母細(xì)胞中，然后檢測(cè)NF2和活化的YAP的水平。結(jié)果顯示補(bǔ)充Nf2 mRNA后Bnc1tr/tr小鼠卵母細(xì)胞中NF2的表達(dá)顯著增加，而核YAP的水平顯著減少（Fig. 7a）。然后檢測(cè)了YAP特異性抑制劑VP靶向YAP的效果。結(jié)果顯示，與Bnc1tr/tr小鼠比較，注射VP的Bnc1tr/tr小鼠的原始卵泡的數(shù)量增加，過度激活

的卵泡減少（Fig. 7b），TFRC和COX2的表達(dá)下降（Fig. 7c, d），F(xiàn)e2+含量顯著下降（Fig. 7e），脂質(zhì)過氧化下降（Fig. 7f）。以上結(jié)果表明靶向NF2-Hippo/YAP通路可挽救Bnc1突變誘導(dǎo)的鐵死亡。

圖7靶向NF2-Hippo/YAP信號(hào)通路挽救Bnc1突變誘導(dǎo)的鐵死亡

8、抑制鐵死亡改善Bnc1突變誘導(dǎo)的POI

最后作者探究了鐵死亡抑制劑Fer-1對(duì)小鼠POI的藥理改善作用。結(jié)果如圖8所示，與Bnc1tr/tr小鼠比較，F(xiàn)er-1處理的Bnc1tr/tr小鼠的卵巢重量增加，卵巢/體重比升高（Fig. 8a, b），閉鎖卵泡數(shù)量無顯著變化（Fig. 8c），紊亂發(fā)情周期的持續(xù)時(shí)間縮短（Fig. 8d），脂質(zhì)過氧化水平下降（Fig. 8e），GPX4表達(dá)升高和COX2表達(dá)升高（Fig. 8f）。這些結(jié)果表明Fer-1阻斷鐵死亡可改善Bnc1缺失引起的POI。

圖8 Fer-1可部分改善Bnc1截?cái)嗤蛔兊?/span>POI表型

總之，BNC1直接調(diào)控Nf2的表達(dá)。BNC1缺失下調(diào)NF2表達(dá)，降低YAP磷酸化，促進(jìn)YAP核積累。YAP的激活上調(diào)了Tfrc和Acsl4的表達(dá)，隨之而來的是鐵的吸收增加和脂質(zhì)ROS的產(chǎn)生增強(qiáng)，最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞鐵死亡（圖9）。

圖9 BNC1-Merlin-Hippo-YAP signaling-Ferroptosis信號(hào)軸示意圖。

參考文獻(xiàn)：

Wang Feixia., Liu Yifeng., Ni Feida., Jin Jiani., Wu Yiqing., Huang Yun., Ye Xiaohang., Shen Xilin., Ying Yue., Chen Jianhua., Chen Ruixue., Zhang Yanye., Sun Xiao., Wang Siwen., Xu Xiao., Chen Chuan., Guo Jiansheng., Zhang Dan.(2022). BNC1 deficiency-triggered ferroptosis through the NF2-YAP pathway induces primary ovarian insufficiency. Nat Commun, 13(1), 5871. doi:10.1038/s41467-022-33323-8