單細(xì)胞測序顯示肝細(xì)胞癌中的免疫抑制景觀

肝細(xì)胞癌占原發(fā)性肝癌病例的75-85%，是全球第三大癌癥相關(guān)死亡原因。近日，有研究的通過檢測肝細(xì)胞癌腫瘤免疫微環(huán)境(TIME)，對單細(xì)胞和大塊組織測序數(shù)據(jù)的綜合分析來研究肝細(xì)胞癌的時間，揭示了肝細(xì)胞癌的時間格局，突出了主要免疫細(xì)胞類型的異質(zhì)性及其在形成免疫抑制環(huán)境中的潛在機(jī)制。作者認(rèn)為阻斷時間的形成可能是治療肝癌的一種有用的治療策略。該研究發(fā)表于《Frontiers in immunology》，IF：8.786。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析確定了細(xì)胞組成

該研究納入了7個HCC樣本和相應(yīng)的正常組織。通過質(zhì)控的細(xì)胞共有39667個，其中21121個來自腫瘤組織，其余來自正常組織。然后這些細(xì)胞被分成36個簇(圖1A)，前5個最重要的基因突出顯示在熱圖上(圖1B)。HCC中有9種主要的細(xì)胞類型，除肝細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、組織干細(xì)胞外，還有許多免疫細(xì)胞(PRPTC+)，包括T細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞(圖1D、E)。在研究9種細(xì)胞系的分布時，作者注意到腫瘤組織中的主要細(xì)胞類型為肝癌細(xì)胞，而正常組織中的主要細(xì)胞類型為T細(xì)胞(圖1C)。瘤內(nèi)和瘤周組織中T細(xì)胞和NK細(xì)胞的差異很大。作者認(rèn)為，腫瘤組織中T細(xì)胞和NK細(xì)胞的耗竭與免疫抑制的形成有關(guān)，與腫瘤的進(jìn)展有不可分割的聯(lián)系。與T細(xì)胞和NK細(xì)胞相比，HCC腫瘤組織中巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的比例增加(圖1F)。新抗原是腫瘤特異性抗原(TSAs)，來源于癌細(xì)胞中突變基因的表達(dá)，在正常組織中不存在。這些新抗原可吸引巨噬細(xì)胞以及單核細(xì)胞分化的DCs，后者可吞噬和呈遞這些新抗原，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞在HCC腫瘤組織中聚集。隨后，分析了腫瘤組織與正常組織之間的基因表達(dá)差異(表S1)，選出了表達(dá)量最高的5個基因，分別是腫瘤組織中的SPP1、AKR1C2、AKR1B10、AGT、EPHX1和正常組織中的NKG7、KLRD1、KLRB1、CCL5、CST7。然后標(biāo)記上述基因在各細(xì)胞系中的表達(dá)情況(圖1G, H)。正常組織中的高表達(dá)基因主要分布在T細(xì)胞和NK細(xì)胞中，且NKG7、KLRD1、KLRB1是T細(xì)胞和NK細(xì)胞的標(biāo)記基因。

圖1 肝癌的細(xì)胞類型分類

2. Treg細(xì)胞在HCC中富集，具有明顯的代謝特征

為了研究T細(xì)胞的異質(zhì)性，將12,884 個T細(xì)胞分為15個亞組，主要有4種細(xì)胞亞型:CD8+Tem、CD4+Tem、CD8+Tcm和Treg細(xì)胞。其中，CD8+ Tem細(xì)胞在正常組織中所占比例最高，而CD4+ Tem、CD8+ Tcm、Treg細(xì)胞主要在HCC組織中發(fā)現(xiàn)(圖2C, D)。四種t細(xì)胞亞型的前三種標(biāo)記基因如圖2E所示。接下來，作者確定了四種t細(xì)胞亞型中免疫檢查點的表達(dá)水平(圖2F)。一些抑制檢查點，如TIGIT, CTLA4, TNFRSF4和TNFRSF9，僅在Treg細(xì)胞中過表達(dá)。盡管Treg細(xì)胞是免疫細(xì)胞的次要組成部分，但在時間網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Treg細(xì)胞抑制抗癌免疫，阻礙對癌癥的保護(hù)性免疫監(jiān)視，阻止有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)的形成，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。上述僅在Treg細(xì)胞中高表達(dá)的免疫檢查點可以被認(rèn)為是在HCC中恢復(fù)對癌細(xì)胞免疫的潛在治療靶點。此外，坐著利用Monocle2 R包繪制了T細(xì)胞分化軌跡(圖2G, H)。來自HCC組織的Treg細(xì)胞主要分布在分化軌跡的起點和終點，而CD8+ Tem細(xì)胞主要分布在分化軌跡的中間。通過調(diào)控Treg細(xì)胞分化和發(fā)育來耗盡和控制Treg細(xì)胞的策略值得進(jìn)一步探索。此外，GSEA結(jié)果顯示，與其他t細(xì)胞亞型相比，Treg細(xì)胞富集了糖酵解、糖異生、谷胱甘肽代謝、淀粉和蔗糖代謝等代謝途徑(圖2I)，表明HCC中Treg細(xì)胞不受代謝抑制，具有代謝的靈活性。該項研究結(jié)果將有助于更好地理解異常Treg細(xì)胞代謝的促腫瘤機(jī)制及其對分化和發(fā)展過程的影響。

圖2 Treg細(xì)胞在HCC中富集，具有明顯的代謝特征

3. 巨噬細(xì)胞與肝癌的免疫抑制環(huán)境有關(guān)

為了研究HCC微環(huán)境中的相互作用網(wǎng)絡(luò)，采用基于python的細(xì)胞-細(xì)胞通訊分子分析工具CellphoneDB識別TME中的配體-受體對。使用Cytoscape對生成的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。在HCC組織中，除了上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞外，巨噬細(xì)胞與其他細(xì)胞類型的交流最為豐富(圖3A)，可見巨噬細(xì)胞在TME中起著重要作用。為了評估巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性，作者將所有巨噬細(xì)胞聚為8個亞簇(圖3B)。通過對細(xì)胞來源的注釋，簇1、2、4和7僅來自癌癥組織，而簇3和8僅來自正常組織。此外，簇5和簇6同時來自癌癥組織和正常組織(圖3C, D)。由于越來越多的證據(jù)顯示TREM2在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)和骨髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)中發(fā)揮作用，作者分析了TREM2在8個簇中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TREM2在簇1、簇2和簇4中表達(dá)高(圖3E)，這些簇都來自癌癥組織。為了進(jìn)一步研究TREM2的臨床價值，將TCGA LIHC隊列中360例HCC患者根據(jù)TREM2的表達(dá)水平分為兩組。過表達(dá)TREM2組的預(yù)后明顯較差(圖3F)，提示TREM2可能在TME的免疫抑制中起重要作用。隨后，確定免疫檢查點在8個聚類中的表達(dá)。簇1和簇4的LAIR1表達(dá)水平高于其他簇(圖3G)。LAIR1可以阻斷LAIR1和TGF-b信號通路來重塑TME，使PD - L1介導(dǎo)的腫瘤根除成為可能。作者的結(jié)果也表明PD - L1介導(dǎo)的腫瘤根除可能是一種潛在的治療策略。GSVA顯示，聚類4的細(xì)胞中脂肪生成、脂肪酸代謝和膽油酸代謝通路富集，而炎癥反應(yīng)以及M2-like TAMs的特征，補(bǔ)體和干擾素(IFN)通路被顯著抑制(圖3H)。樹突狀細(xì)胞在與腫瘤代謝密切相關(guān)的過程中更顯著地富集，如上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、缺氧和血管生成。最后，分析了TFs在各個子組中的表達(dá)情況。與其他簇相比，簇1和簇4的KLF6、PRDM1、STAT1、JUNB和HES1表達(dá)更高(圖3I)。這些結(jié)果表明巨噬細(xì)胞在TME免疫抑制中的重要作用，以及參與這一過程的潛在機(jī)制和TFs。

圖3 巨噬細(xì)胞與TME的免疫抑制環(huán)境有關(guān)

4. 兩種不同的NK細(xì)胞亞群在HCC中具有不同的細(xì)胞毒性

在瘤周和腫瘤組織中分別檢測到3151個和187個NK細(xì)胞，并將其聚類為11個子集(圖4A, B)。如前所述，與正常組織相比，腫瘤組織中NK細(xì)胞的比例顯著降低。在HCC中NK細(xì)胞明顯減少，提示癌細(xì)胞形成了一種抑制NK細(xì)胞增殖的環(huán)境，可能通過缺氧或代謝抑制，直接導(dǎo)致NK細(xì)胞抵抗攻擊。NK細(xì)胞在腫瘤和正常組織間的差異基因如圖4C所示(圖4C)。另外，腫瘤來源的NK細(xì)胞分布在簇9和10中，而其他簇的NK細(xì)胞則來自正常組織(圖4A、B)。為了研究簇9和簇10的異質(zhì)性，檢測了NK細(xì)胞激活受體CD160、NCR3、IFNG (IFNG)和FASLG在簇9、簇10和正常組織中的表達(dá)(圖4D)：與簇9的細(xì)胞相比，簇10的細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，而簇9的細(xì)胞則呈現(xiàn)出衰竭狀態(tài)，這表明NK細(xì)胞在腫瘤和慢性感染的情況下會耗盡，表現(xiàn)出低細(xì)胞毒性和效應(yīng)功能。偽時間分析發(fā)現(xiàn)，簇10細(xì)胞出現(xiàn)在分化軌跡的開始階段，而簇9細(xì)胞則出現(xiàn)在分化軌跡的結(jié)束階段，這是一個耗盡的NK細(xì)胞子集(圖4E)。作者認(rèn)為cluster 10細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)化為cluster 9細(xì)胞，腫瘤浸潤并形成TME。隨后，通過SCENIC分析發(fā)現(xiàn)，CEBPD、FOS和JUN調(diào)控的基因在cluster 10中顯著激活(圖4F)。這些結(jié)果證實了在HCC中存在兩種具有不同細(xì)胞毒性的NK細(xì)胞簇，并提示TME可能逐漸發(fā)展出多種抑制NK細(xì)胞免疫毒性的機(jī)制。

圖4 兩種不同的NK細(xì)胞亞群在HCC中具有不同的細(xì)胞毒能力

5. HCC中記憶B細(xì)胞低活性狀態(tài)

1395個B細(xì)胞，分為6個簇，并標(biāo)注為4個亞型:B細(xì)胞、未成熟B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞和漿細(xì)胞(圖5A)。幾乎所有未成熟B細(xì)胞都來自正常組織，而記憶B細(xì)胞則來自腫瘤組織(圖5B, C)。對記憶B細(xì)胞子集進(jìn)行了進(jìn)一步的分析，確定了腫瘤組織和正常組織之間記憶B細(xì)胞亞群的差異(圖5D)。利用CytoTRACE預(yù)測腫瘤來源記憶B細(xì)胞具有更高的分化潛能(圖5E, F)。同樣，比較不同組織來源記憶B細(xì)胞亞型的細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，腫瘤來源記憶B細(xì)胞更大比例處于G2/M期，表明其增殖能力更強(qiáng)，與腫瘤來源記憶B細(xì)胞低分化狀態(tài)相一致(圖5G)。另外，腫瘤組織中處于激活狀態(tài)的記憶B細(xì)胞明顯少于瘤周組織(p = 0.011)，這可能與抗腫瘤反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)(圖5H)。鑒于TME和癌細(xì)胞之間的串?dāng)_在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，作者比較了癌細(xì)胞和記憶B細(xì)胞之間的受體-配體對。發(fā)現(xiàn)與CD74+CXCR4+和CD74+CD44+相互作用的巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)在腫瘤樣本中特異性表達(dá)(圖5I)。這也是首次發(fā)現(xiàn)MIF可抑制HCC中的記憶b細(xì)胞活性，抑制MIF-CD74軸可能是一種新的治療策略。

圖5 HCC中記憶B細(xì)胞低活性狀態(tài)

6. 肝癌細(xì)胞的高代謝和免疫抑制

作者發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中存在明顯的CNV。同時，肝癌細(xì)胞中APOA2、APOA1、AMBP、TTR、APOH、ASGR1表達(dá)水平高。此外，來自同一患者的肝癌細(xì)胞往往聚集在一起(圖6A)，這表明不同患者的肝癌細(xì)胞之間存在顯著的異質(zhì)性。通過scRNA-seq數(shù)據(jù)分析檢測肝癌細(xì)胞與肝細(xì)胞之間的DEGs：MT1M, MT1H, MT1G, MT1F, MT1E, MT1X和MT1A，在癌細(xì)胞中顯著下調(diào) (Table S2和Figure 6B)。GO富集分析顯示，上調(diào)的DEGs主要富集于核糖核苷酸代謝過程、嘌呤核苷酸代謝過程、前體代謝物和能量產(chǎn)生(圖6C)。GSVA結(jié)果與GO富集分析結(jié)果基本一致(圖6D)，癌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)受到明顯抑制。SCENIC分析顯示，HSF1在癌細(xì)胞中顯著上調(diào)，HSF1通過誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)來維持應(yīng)激環(huán)境下的蛋白穩(wěn)定(圖6H)。

為了根據(jù)癌細(xì)胞分化程度對HCC患者進(jìn)行分層，并提供精確的治療建議，作者又進(jìn)行了癌細(xì)胞分化軌跡(圖6E)。不同的腫瘤細(xì)胞分化狀態(tài)影響腫瘤細(xì)胞分化、進(jìn)展以及患者預(yù)后。因此，使用ConsensusClusterPlus根據(jù)這些DEGs將TCGA LIHC患者分為3個簇(圖6F)。K-M分析顯示，聚類2組患者的OS明顯短于聚類1和聚類3組患者(圖6G)。聚類2組患者中晚期及腫瘤低分化患者較多，說明不同分化程度的癌細(xì)胞具有不同的侵襲能力，影響癌癥進(jìn)展。

圖6 肝癌細(xì)胞的高代謝與免疫抑制

結(jié)論：

這項研究揭示了HCC的時間格局，強(qiáng)調(diào)了主要免疫細(xì)胞類型的異質(zhì)性及其在免疫抑制環(huán)境形成中的潛在機(jī)制，為調(diào)節(jié)HCC的時間提供了新的理論基礎(chǔ)，并將有助于新的免疫療法的開發(fā)。