基于單細(xì)胞測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組分析的胰腺癌壞死相關(guān)預(yù)后模型

胰腺癌作為一種死亡率高、療效差的腫瘤類型，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。目前有作者通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)、ICGC數(shù)據(jù)庫(kù)和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（GSE85916），利用單細(xì)胞測(cè)序分析和轉(zhuǎn)錄組分析構(gòu)建了胰腺癌壞死性凋亡相關(guān)的標(biāo)記，構(gòu)建胰腺癌預(yù)后模型，為胰腺癌的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供參考。該研究發(fā)表在《Frontiers in Immunology》，IF：8.786。

實(shí)驗(yàn)方法：

將TCGA隊(duì)列設(shè)置為訓(xùn)練隊(duì)列，將ICGC和GSE85916隊(duì)列設(shè)置為驗(yàn)證隊(duì)列。胰腺癌單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)自GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的GSE154778。通過(guò)加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析和單細(xì)胞測(cè)序分析，確定了與壞死最相關(guān)的基因。對(duì)這些基因進(jìn)行COX回歸和Lasso回歸，建立預(yù)后模型。通過(guò)計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，將胰腺癌患者分為NCPTS_high組和NCPTS_low組，進(jìn)行組間生存分析、免疫浸潤(rùn)分析和突變分析。通過(guò)基因敲除、CCK-8實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、transwell實(shí)驗(yàn)和創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)等細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探討關(guān)鍵基因EPS8在胰腺癌中的作用。對(duì)臨床樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，驗(yàn)證EPS8的表達(dá)。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

該研究的流程圖如圖1所示。如圖2A, B所示，采用ssGSEA對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行壞死性凋亡（necroptosis）評(píng)分。根據(jù)壞死評(píng)分中位數(shù)將患者分為高壞死組和低壞死組，較高的壞死評(píng)分胰腺癌患者死亡率很高。此外，高壞死組患者預(yù)后較差（P <0.05），提示壞死性凋亡是胰腺癌的危險(xiǎn)因素。使用WGCNA進(jìn)一步尋找與壞死性凋亡共變的基因集。如圖2C所示，當(dāng)軟域值為7，R^2>0.8時(shí)，數(shù)據(jù)更符合冪律分布，平均連通性趨于穩(wěn)定，適合后續(xù)分析。如圖2D所示，共得到27個(gè)非灰色模塊。然后，將模塊的相似度域值設(shè)置為0.4，對(duì)低于該值的模塊進(jìn)行合并，最終得到16個(gè)非灰度模塊。作者發(fā)現(xiàn)，MEgreenyellow模塊與壞死性凋亡密切相關(guān)，包含3352個(gè)基因（COR = 0.8, P <0.001）（圖2E, F）。

圖1實(shí)驗(yàn)流程圖

圖2單樣本基因集富集分析（ssGSEA）和加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）

2. 單細(xì)胞測(cè)序分析

如圖3A所示，研究共納入14個(gè)樣本，各樣本間細(xì)胞分布較為均勻，說(shuō)明樣本間不存在明顯的批量效應(yīng)，可用于后續(xù)分析。隨后，所有細(xì)胞聚類為14個(gè)簇（圖3B），分為8種細(xì)胞類型（圖3C），如上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞。根據(jù)每個(gè)細(xì)胞中壞死基因的特點(diǎn)，確定每個(gè)細(xì)胞中壞死基因的百分比。根據(jù)中位數(shù)將細(xì)胞分為高、低兩組，即高NCPTS組和低NCPTS組（圖3D）。經(jīng)P <0.05差異分析，兩組間有2518個(gè)差異表達(dá)基因。如圖3E所示，變化最顯著的前10個(gè)基因分別是RPL8、AIF1、HLA-DQB1、LST1、HLA-DPA1、RPL7、MS4A7、SPINK1、RPL13A、RPLP0。同時(shí)，基因本體富集分析表明，這些基因主要與mRNA代謝和蛋白質(zhì)定位有關(guān)（圖3F）。最后，將差異表達(dá)基因與綠綠黃模塊基因交叉得到805個(gè)與壞死性凋亡密切相關(guān)的基因。

圖3單細(xì)胞測(cè)序分析

3. TCGA隊(duì)列中預(yù)后模型的構(gòu)建與評(píng)價(jià)

為了進(jìn)一步鑒定與預(yù)后相關(guān)的壞死基因，對(duì)TCGA和PA-AU組805個(gè)壞死基因進(jìn)行單因素Cox分析，鑒定出48個(gè)壞死基因，（p<0.05）。TCGA隊(duì)列采用forest-map顯示48個(gè)基因的單變量Cox分析結(jié)果（圖4A），然后進(jìn)行LASSO回歸。如圖4B, C所示，最優(yōu)Lambda為0.0678，最終得到由8個(gè)基因構(gòu)建的模型。根據(jù)中位數(shù)將患者分為NCPTS_high組和NCPTS_low組。如圖4D所示，NCPTS_high組患者預(yù)后不良（P<0.001）。ROC曲線顯示，模型值NCPTS預(yù)測(cè)患者預(yù)后的AUC維持在0.75左右，明顯優(yōu)于性別、年齡、分期等臨床特征（圖4E）。同樣，決策曲線分析發(fā)現(xiàn)，與臨床特征相比，患者從基于NCPTS的臨床干預(yù)中獲益最多（圖4F）。多變量Cox分析顯示，NCPTS是胰腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素（圖4G）。此外，該模型可以更好地將患者區(qū)分為NCPTS_high和NCPTS_low組（圖4H）。

圖4 TCGA隊(duì)列預(yù)后模型的建立

4. 預(yù)后模型的外部驗(yàn)證和評(píng)估

在外部驗(yàn)證隊(duì)列PA-AU（圖5A-E）、PA-CA（圖5F-J）和GSE85916（圖5K-O）中也觀察到了類似的結(jié)果。在PA-AU隊(duì)列（圖5A-E）和PA-CA隊(duì)列（圖5F-J）中，NCPTS_high組患者的預(yù)后較NCPTS_low組患者差。此外，預(yù)后ROC分析顯示，曲線下AUC波動(dòng)在0.85 ~ 0.7之間，對(duì)患者的預(yù)后評(píng)估有較好的效果，優(yōu)于性別、年齡等臨床特征（圖5B, G）。決策曲線分析也顯示，以NCPTS為干預(yù)依據(jù)的患者獲益最大（圖5C, H）。多因素Cox分析顯示，NCPTS是影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素（圖5D, I），并且該模型能夠很好地將患者區(qū)分為NCPTS_high和NCPTS_low組（圖5E, J）。同樣，在GSE85916隊(duì)列中，發(fā)現(xiàn)NCPTS_high患者的預(yù)后較差，通過(guò)預(yù)后ROC分析發(fā)現(xiàn)曲線下AUC較為穩(wěn)定，波動(dòng)為0.65（圖5K, L）。通過(guò)決策曲線分析也表明基于NCPTS的臨床干預(yù)具有合理的效益效果（圖5M）。單因素Cox分析顯示，NCPTS是一個(gè)預(yù)后因素（圖5N）。此外，該模型仍然可以將患者區(qū)分為NCPTS_high和NCPTS_low組（圖5O）。

圖5預(yù)測(cè)模型的外部驗(yàn)證和評(píng)估

5. 免疫浸潤(rùn)分析和識(shí)別更適合免疫治療的患者

免疫微環(huán)境在患者預(yù)后中起著重要作用。分析NCPTS_low組和NCPTS_high組的免疫浸潤(rùn)情況。如圖6A-D所示，與NCPTS_high組相比，NCPTS_low組的估計(jì)評(píng)分、免疫評(píng)分和間質(zhì)評(píng)分較高（P<0.001），但腫瘤純度較低。與上述結(jié)果類似， NCPTS_low組的T細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平更高（圖6E）。免疫原性細(xì)胞死亡基因（ICDs）、人類白細(xì)胞抗原（HLAs）和免疫檢查點(diǎn)（ICPs）也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)（圖6F）。在NCPTS_low組中，ICDs表達(dá)整體呈下降趨勢(shì)，HGF、TLR4、P2RX7、FPR1表達(dá)上調(diào) （圖6G）。NCPTS_low組HLAs整體表達(dá)上調(diào)，而HLA-G表達(dá)下調(diào)（圖6H）。NCPTS_low組ICPs表達(dá)普遍上調(diào)，如PDCD1、CD27、CTLA4等。然后，根據(jù)模型中的基因?qū)颊哌M(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類分析，發(fā)現(xiàn)患者可以聚為2類（圖6I-J）。與Cluster1相比，Cluster2的預(yù)后較差（P<0.05）。隨后，探究NCPTS分組與聚類以及免疫亞型之間的關(guān)系（圖6K）：Cluster1主要與NCPTS_low組相關(guān)，免疫亞型C3和C6主要分布在NCPTS_low組。Cluster2主要與NCPTS_high組相關(guān)，免疫亞型C1和C2主要分布于NCPTS_high組。隨后，進(jìn)行免疫亞型之間的生存分析（圖6L）：發(fā)現(xiàn)免疫亞型C3組預(yù)后最好，而C3主要分布在NCPTS_low組，這與前期結(jié)果一致。綜上，NCPTS_low組有較高水平的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，ICPs和HLAs的表達(dá)也較高，且免疫亞型C2主要分布在該組。作者假設(shè)NCPTS_low組可能免疫“熱”腫瘤，而NCPTS_HIGH組可能免疫“冷”腫瘤。然后觀察NCPTS組之間的免疫治療反應(yīng)情況（圖6M, N），發(fā)現(xiàn)NCPTS_low組的TIDE較低，說(shuō)明免疫逃逸腫瘤的可能性較低，患者獲得免疫治療獲益的可能性較大（圖6M）。此外，TIDE與NCPTS呈強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系（圖6N），即隨著NCPTS的增加，TIDE值也隨之增加，腫瘤免疫逃逸的概率也隨之增加，免疫治療的獲益更少。

圖6 TCGA隊(duì)列中更適合免疫治療的患者免疫浸潤(rùn)分析及鑒別

6. 突變景觀分析

基因突變?cè)谀[瘤發(fā)生發(fā)展和患者預(yù)后中也起著重要作用。在NCPTS_high組和NCPTS_low組中，突變頻率最高的5個(gè)基因分別是KRAS、TP53、SMAD4、CDKN2A和TTN（圖7A，B）。NCPTS_high組TMB較高，且TMB與NCPTS呈正相關(guān)（P<0.001）（圖7C，D）。TMB常與患者預(yù)后不良相關(guān)，這可能是NCPTS_high組預(yù)后不良的原因。隨后，對(duì)兩組通路進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)NCPTS_high組激活了與細(xì)胞周期相關(guān)的G2M_CHECKPOINT和E2F_TARGETS通路（圖7E，F(xiàn)）。

圖7突變景觀分析

7. 模型的臨床意義

對(duì)不同隊(duì)列NCPTS的預(yù)后影響進(jìn)行了薈萃分析。在圖8A中，發(fā)現(xiàn)合并的HR值表明NCPTS仍然是患者預(yù)后不良的一個(gè)促成因素。為了進(jìn)一步促進(jìn)臨床胰腺癌患者風(fēng)險(xiǎn)組的分類和管理，對(duì)NCPTS和臨床特征進(jìn)行了決策樹分析。根據(jù)NCPTS水平、性別、N期可將患者分為4個(gè)危險(xiǎn)組：RIS1、RIS2、RIS3、RIS4（圖8B）。RIS4患者均分布在NCPTS_high組，而RIS1、RIS2、RIS3患者分布在NCPTS_low組（圖8C）。生存分析發(fā)現(xiàn)，RIS4組預(yù)后不良（P<0.001，圖8D）。最后構(gòu)建nomogram圖， TCGA-2J-AABK患者1年、3年和5年的死亡率分別為18.5%、62.5%和75.2%（圖8E）。預(yù)后ROC曲線分析和決策曲線分析進(jìn)一步評(píng)價(jià)Nomogram應(yīng)用價(jià)值（圖8F）。Nomogram預(yù)測(cè)患者預(yù)后的AUC值保持在0.8左右，明顯高于其他臨床特征?；贜omogram臨床及時(shí)治療患者的獲益率高于其他臨床特征（圖8G）。

圖8模型的臨床意義

8. 體外驗(yàn)證關(guān)鍵基因EPS8在胰腺癌細(xì)胞株中的作用

在CAPAN-1和PANC-1細(xì)胞系中，EPS8顯著減少（圖9A）。在CAPAN-1和PANC-1細(xì)胞系中，EPS8敲除后胰腺癌細(xì)胞的活性顯著降低（圖9B）。隨后，克隆形成試驗(yàn)顯示，EPS8敲除后，CAPAN-1細(xì)胞系（圖9C）和PANC-1細(xì)胞系（圖9D）產(chǎn)生菌落的能力大大降低。在transwell實(shí)驗(yàn)中，EPS8的敲除顯著降低了CAPAN-1細(xì)胞系和PANC-1細(xì)胞系中胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖9E, F）。創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)中，si-EPS8組EPS8在CAPAN-1細(xì)胞和PANC-1細(xì)胞中的遷移能力較弱（圖9G, H）。

圖9體外驗(yàn)證了關(guān)鍵基因EPS8在胰腺癌細(xì)胞系中的作用

9. 通過(guò)對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行PCR檢測(cè)，驗(yàn)證EPS8在胰腺癌組織中的表達(dá)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證EPS8在臨床標(biāo)本中的表達(dá)，進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，胰腺癌組織中EPS8表達(dá)明顯上調(diào)（圖10）。

圖10 EPS8表達(dá)的臨床驗(yàn)證

結(jié)論：

通過(guò)結(jié)合單細(xì)胞測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果，作者構(gòu)建了胰腺癌的壞死性凋亡相關(guān)預(yù)后特征，該的預(yù)測(cè)特征可以有效評(píng)估胰腺癌患者的預(yù)后，在一定程度上為胰腺癌的治療提供參考。