m6A修飾的lncRNA ARHGAP5-AS1參與肝細胞癌的進展

肝細胞癌（HCC）在全球導致癌癥相關死亡的惡性腫瘤中排名第四。lncRNA是肝癌發(fā)生的關鍵模式。作為最常見的mRNA修飾形式，m6A通過影響mRNA代謝的多個方面來調節(jié)基因表達。然而，目前還沒有關于肝癌中m6A甲基化lncRNA的全基因組篩選和功能注釋的報道。在系統(tǒng)分析了HCC細胞的m6A-seq數(shù)據后，我們確定了22個具有明顯失調的m6A水平的候選lncRNAs。在這些lncRNAs中，我們發(fā)現(xiàn)ARHGAP5-AS1是m6A修飾水平最高的lncRNA，并且在HCC標本中表達顯著增加。METTL14作為ARHGAP5-AS1的m6A writer，IGF2BP2作為m6A reader穩(wěn)定lncRNA。ARHGAP5-AS1在體內外顯著促進HCC細胞的惡性行為。我們在HCC中發(fā)現(xiàn)CSDE1作為lncRNA的相互作用蛋白，TRIM28作為CSDE1的E3連接酶。有趣的是，ARHGAP5-AS1可以減弱CSDE1和TRIM28之間的相互作用，這通過泛素蛋白酶體途徑阻止CSDE1的降解。CSDE1水平的升高協(xié)調致癌RNA調節(jié)，促進VIM和RAC1的翻譯，激活ERK通路，這有助于HCC的預后。我們的研究揭示了m6A修飾的lncRNA控制CSDE1介導的致癌RNA調控的新模式，并強調lncRNA是未來治療HCC的潛在靶點。本文于2022年10月發(fā)表于“Clinical and Translational Medicine”（IF=8.554）上。

技術路線

結果

1）m6A修飾的ARHGAP5-AS1由METTL14和IGF2BP2控制

為了鑒定在HCC進展中被m6A修飾的lncRNA，我們系統(tǒng)分析了METTL14沉默或不沉默的HepG2細胞的m6A-seq數(shù)據（圖1A）。HepG2細胞中有22個lncRNA具有顯著差異的m6A修飾。在這些lncRNA中，8個lncRNAs（ARHGAP5-AS1、LINC00152、C1QTNF1-AS1、LINC00969、USP27X-AS1、NDUFB2-AS1、TEN1-CDK3和ABALON）的水平與TCGA肝癌（LIHC）患者的預后顯著相關。我們驗證了這些候選lncRNA在HCC細胞中的m6A修飾水平（圖1B）。m6A RIP分析表明ARHGAP5-AS1是肝癌細胞中m6A修飾水平最高的lncRNA。通過在HepG2中使用m6A-seq和SRAMP算法，我們鑒定了ARHGAP5-AS1 RNA的三個潛在m6A位點（876A、890A和928A）（圖1C）。隨后的m6A特異性RIP偶聯(lián)RT-qPCR分析表明，與異位表達WT ARHGAP5-AS1的細胞相比，異位表達ARHGAP5-AS1突變體3的細胞中ARHGAP5-AS1 RNA的m6A水平顯著降低（圖1D，E）。我們接下來研究了我們HCC患者隊列中的m6A-ARHGAP5-AS1 RNA水平，發(fā)現(xiàn)腫瘤的m6A-ARHGAP5-AS2 RNA水平明顯高于正常組織（圖1F）。細胞中沉默METTL14后（圖1G），我們觀察到m6A修飾水平和ARHGAP5-AS1的表達水平明顯降低（圖1H，I）。與此一致，METTL14和ARHGAP5-AS1在HCC組織和正常肝組織中的表達存在顯著相關性（圖1J）。RIP-qPCR測定表明，IGF2BP2是與HCC細胞中ARHGAP5AS1具有最高結合親和力的閱讀蛋白（圖1K）。IGF2BP2的沉默顯著降低了HCC細胞中ARHGAP5-AS1的內源性水平（圖1L，M）。總之，這些數(shù)據闡明METTL14作為ARHGAP5-AS1的m6A寫入器，IGF2BP2作為其m6A讀取器，穩(wěn)定HCC細胞中ARHGAP5-AS1。

2）ARHGAP5-AS1在體外和體內促進HCC細胞增殖

為了探討ARHGAP5-AS1在肝癌發(fā)生中的作用，我們首先在山東隊列和江蘇隊列的HCC標本和配對正常組織中檢測了其水平（圖2A）。與山東隊列或江蘇隊列中的正常肝臟樣本相比，HCC組織中ARHGAP5-AS1明顯上調（圖2A）。HCC標本中高ARHGAP5-AS1水平與無進展生存期（PFS）或總生存期（OS）的縮短相關（圖2B）。為了揭示ARHGAP5-AS1在HCC中的生物學意義，我們開發(fā)了穩(wěn)定的ARHGAP5AS1-KD HepG2和SK-HEP-1細胞和穩(wěn)定的ARHGAP5-AS1-OE HCC細胞。如圖2C所示，與對照組相比，穩(wěn)定的ARHGAP5-AS1-KD明顯抑制了HCC細胞株的增殖。穩(wěn)定的ARHGAP5-AS1OE可顯著增強HCC細胞增殖（圖2D）。集落形成結果也支持ARHGAP5-AS1在HCC中的致癌作用（圖2E）。然后我們在體內檢測了ARHGAP5-AS1的致癌功能。我們發(fā)現(xiàn)，與對照異種移植相比，ARHGAP5-AS1-KD HCC異種移植生長明顯緩慢（圖2F）。與對照組相比，ARHGAP5-AS1-KD組的腫瘤重量也明顯降低（圖2F），這支持ARHGAP5-AS1在HCC中的致癌作用。

3）ARHGAP5-AS1降低HCC細胞的遷移、侵襲和轉移能力

我們評估了ARHGAP5-AS1在體外和體內HCC細胞轉移行為中的作用。ARHGAP5-AS1的穩(wěn)定沉默顯著削弱了HepG2或SK-HEP-1細胞的細胞運動性（圖3A）。相反，ARHGAP5-AS1的強制表達促進了HepG2或SK-HEP-1細胞的遷移（圖3B）。Matrigel侵襲試驗表明ARHGAP5-AS1-KD損害了HCC細胞的侵襲（圖3B）。相反，ARHGAP5-AS1的過表達加速了HCC細胞的侵襲（圖3B）。體內HCC轉移結果顯示，注射惡性細胞后，ARHGAP5AS1的沉默可顯著損害HCC細胞的肺和其他器官的遠處轉移（圖3C）?？傊@些數(shù)據表明ARHGAP5-AS1可以增強體內外HCC細胞的運動性和侵襲性。

4）ARHGAP5-AS1通過蛋白酶體抑制CSDE1降解

越來越多的證據表明，lncRNA在腫瘤發(fā)生過程中可能通過與各種蛋白質相互作用發(fā)揮作用。因此，我們假設ARHGAP5-AS1可能作為結合某些蛋白質的支架來促進HCC的發(fā)展。為了驗證這一點，我們檢查了ARHGAP5-AS1的細胞定位，發(fā)現(xiàn)ARHGAP5-AS1幾乎同樣存在于HCC細胞的細胞核或細胞質中（圖4A）。使用質譜蛋白質組學，我們鑒定了多種癌癥相關蛋白，包括CSDE1、ZC3HAV1、CCT8、CKAP4、PARP1、PEG10和APEX1在HepG2中的表達。在HCC細胞中進行了獨立檢測，并成功驗證了這些候選蛋白中的CSDE1（圖4B）。與此一致，HCC細胞系中RNA-CSDE1復合物中存在顯著的ARHGAP5-AS1富集（圖4C）。為了探索lncRNA與CSDE1相互作用所需的特定結構域，我們隨后構建了各種截短的CSDE1（圖4D），并發(fā)現(xiàn)CSDE1 RNA結合基序2（aa450-525）是ARHGAP5-AS1與蛋白質相互作用所必需的（圖4E）。有趣的是，ARHGAP5-AS1的沉默顯著抑制了HCC細胞中的CSDE1蛋白水平（圖4F）。相反，過表達的ARHGAP5-AS1顯著上調了HepG2和SK-HEP-1細胞中的CSDE1蛋白（圖4F）。與對照HCC細胞相比，MG132處理ARHGAP5-AS1-KD HCC細胞增加了內源性CSDE1蛋白的表達（圖4G）。相反，MG132消除了ARHGAP5-AS1誘導的HCC細胞中CSDE1蛋白的上調（圖4G），說明lncRNA可能調節(jié)CSDE1的蛋白酶體降解。為了證實這一點，我們接下來檢測了用蛋白質合成抑制劑CHX處理過的HepG2和SK-HEP-1細胞中CSDE1的表達。Western Blot的結果表明，穩(wěn)定的ARHGAP5-AS1-KD HCC細胞中CSDE1的蛋白質水平下降速度比對照細胞中的快得多（圖4H）。相反，用CHX處理過表達ARHGAP5-AS1的HCC細胞導致CSDE1蛋白的半衰期明顯長于對照細胞（圖4I）。然后，我們研究了ARHGAP5-AS1控制的CSDE1降解是否由CSDE1的泛素化介導。與對照組相比，穩(wěn)定的ARHGAP5-AS1-KD HCC中觀察到CSDE1蛋白的泛素水平明顯增加（圖4J）。與此一致，與對照組相比，過表達ARHGAP5-AS1的細胞中CSDE1的泛素化降低（圖4J）。總之，這些結果闡明了ARHGAP5-AS1通過抑制CSDE1蛋白的蛋白酶體降解來穩(wěn)定CSDE1蛋白。

5）ARHGAP5-AS1阻斷CSDE1與其E3連接酶TRIM28的相互作用

為了揭示ARHGAP5-AS1如何延緩CSDE1的蛋白酶體降解，我們通過質譜系統(tǒng)地評估了由CSDE1在HepG2細胞中沉淀的蛋白質。在所有鑒定的蛋白質中，只有兩種E3連接酶（TRIM28和HERC5）。為了確認TRIM28或HERC5是否是CSDE1的E3連接酶，我們首先檢測了TRIM28和HERC5沉默的HCC細胞中的CSDE1水平（圖5A，B）。在敲除TRIM28表達后，與對照細胞相比，在HCC細胞中檢測到升高的CSDE1蛋白水平（圖5A）。然而，HERC5沉默后，沒有觀察到這種表達變化（圖5B）。內源性TRIM28可以在HepG2或SK-HEP-1細胞中與CSDE1免疫沉淀（圖5C）。內源性CSDE1也可以用TRIM28在HepG2或SK-HEP-1細胞中沉淀（圖5D）。免疫熒光分析顯示，TRIM28和CSDE1在HCC細胞中表現(xiàn)出明顯的共定位（圖5E）。我們接下來研究ARHGAP5-AS1是否影響HCC細胞中CSDE1與TRIM28的結合。與對照組相比，穩(wěn)定的ARHGAP5-AS1-KD HepG2或SK-HEP-1細胞中的CSDE1可以沉淀更多的TRIM28蛋白（圖5F）。相反，與對照細胞相比，穩(wěn)定的ARHGAP5AS1-OE HCC細胞中用CSDE1沉淀的TRIM28蛋白較少（圖5G）。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明ARHGAP5-AS1通過減弱CSDE1與TRIM28的相互作用來促進CSDE1的穩(wěn)定。

6）ARHGAP5-AS1-CSDE1軸促進HCC細胞中VIM和RAC1的蛋白表達以及ERK的磷酸化

多條證據表明，RNA結合蛋白CSDE1在癌癥中充當癌基因，并在轉錄后水平調節(jié)mRNA的翻譯和穩(wěn)定性。事實上，CSDE1的沉默顯著抑制了HCC細胞的增殖和克隆形成（圖6A–C）。transwell分析表明CSDE1的siRNA可以顯著抑制HCC細胞的侵襲能力（圖6D）。與這些數(shù)據一致，在兩個隊列中，與正常樣本相比，HCC組織中的CSDE1表達顯著升高。TCGA LIHC隊列中CSDE1異常高表達與患者OS明顯縮短相關（圖6F），表明CSDE1在HCC中的致癌性質。在CSDE1沉默后，我們觀察到HCC細胞中VIM（Vimentin）和RAC1的蛋白水平明顯降低（圖6G）。同樣，與對照組相比，穩(wěn)定的ARHGAP5-AS1-KD HepG2或SK-HEP-1細胞中的VIM和RAC1表達下調（圖6H）；而異位ARHGAP5-AS1表達顯著提高了VIM和RAC1的表達(圖6I)。有趣的是，ARHGAP5-AS1或CSDE1的敲除降低了細胞中ERK1/2（Thr202/Tyr204）的磷酸化（圖6G，H）。異位ARHGAP5-AS1明顯增強了細胞中ERK1/2磷酸化（圖6I）?？傊@些數(shù)據證明了ARHGAP5-AS1在穩(wěn)定CSDE1蛋白、促進VIM和RAC1翻譯以及激ERK信號傳導方面的作用（圖6J）。

結論：

我們發(fā)現(xiàn)由于ARHGAP5-AS1的高m6A甲基化水平，lncRNA表達顯著升高，加速VIM和RAC1的翻譯，并刺激ERK信號通路，從而促進細胞增殖和轉移。我們研究揭示了m6A修飾的lncRNA控制CSDE1介導的致癌RNA調控的新模式，并強調lncRNA是未來治療HCC的潛在靶點。

參考文獻：

Liu J, Zhang N, Zeng J, Wang T, Shen Y, Ma C, Yang M. N6 -methyladenosine-modified lncRNA ARHGAP5-AS1 stabilises CSDE1 and coordinates oncogenic RNA regulons in hepatocellular carcinoma. Clin Transl Med. 2022 Nov;12(11):e1107. doi: 10.1002/ctm2.1107.