pTINCR微蛋白通過(guò)CDC42 SUMO化和激活促進(jìn)上皮分化,抑制腫瘤生長(zhǎng)

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2023-01-12
我們的研究結(jié)果表明,微蛋白質(zhì)組是與癌癥相關(guān)的細(xì)胞身份的新調(diào)控源。本文于2022年11月11日發(fā)表于Nature ......



人類轉(zhuǎn)錄組包含數(shù)千個(gè)小的開(kāi)放閱讀框(sorf),它們編碼的微蛋白的功能在很大程度上仍未被探索。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)TINCR lncRNA編碼pTINCR, pTINCR是一種進(jìn)化保守的泛素樣蛋白(UBL),在許多上皮細(xì)胞中表達(dá),在分化和細(xì)胞應(yīng)激下表達(dá)上調(diào)。通過(guò)功能獲得和功能喪失的研究,我們證明了pTINCR是體外和體內(nèi)上皮分化的一個(gè)關(guān)鍵誘導(dǎo)因子。有趣的是,在幾種上皮性癌癥中,TINCR的低表達(dá)與較差的預(yù)后相關(guān),而pTINCR的過(guò)表達(dá)降低了患者源性異種移植瘤的惡性程度。在分子水平上,pTINCR通過(guò)SUMO相互作用motif (SIM)與SUMO結(jié)合,并與CDC42結(jié)合,CDC42是一種RhoGTPase,對(duì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑和上皮分化至關(guān)重要。此外,pTINCR增加CDC42的sumo化并促進(jìn)其激活,觸發(fā)促分化級(jí)聯(lián)反應(yīng)。我們的研究結(jié)果表明,微蛋白質(zhì)組是與癌癥相關(guān)的細(xì)胞身份的新調(diào)控源。本文于2022年11月11日發(fā)表于Nature Communications(IF=17.694)。

 

技術(shù)路線:


 

主要研究結(jié)果:

(1) pTINCR是由TINCR lncRNA編碼的一種保守微蛋白,在上皮組織中表達(dá)

TINCR是角化細(xì)胞和其他上皮細(xì)胞分化過(guò)程中上調(diào)的3.7千堿基lncRNA 40 - 42。我們證實(shí)了TINCR在人和小鼠皮膚中表達(dá),也在其他上皮細(xì)胞中表達(dá)(圖1b)。對(duì)TINCR轉(zhuǎn)錄本的保守分析顯示sORF為264 bp(圖1c)。小鼠皮膚核糖體譜分析(RibORF評(píng)分≥0.7)顯示,該sORF被翻譯成一種高度保守的具有87個(gè)氨基酸的微蛋白,我們將其命名為pTINCR(圖1c, d)。為了確認(rèn)pTINCR sORF被翻譯成一種穩(wěn)定的微蛋白,我們?cè)?5s -蛋氨酸存在的情況下,使用全長(zhǎng)TINCR lncRNA (integrl: ENST00000448587.5)進(jìn)行了體外翻譯(圖1e, f),并獲得了約12 kDa的肽產(chǎn)物。值得注意的是,突變pTINCR的起始密碼子會(huì)損害任何可檢測(cè)產(chǎn)物的翻譯(圖1e, f)。

 

 

(2) pTINCR促進(jìn)體外和體內(nèi)上皮分化

為了表征pTINCR的細(xì)胞和分子功能,我們?cè)趶?qiáng)力環(huán)素誘導(dǎo)的慢病毒載體中克隆了標(biāo)記HA表位的pTINCR sORF。我們生成了兩種不同的結(jié)構(gòu),將ha標(biāo)記放置在微蛋白的c端(pTINCR-HA)或n端(HA-pTINCR)部分。為了最大限度地減少標(biāo)簽對(duì)pTINCR的可能影響,我們?cè)贖A和pTINCR sORF之間引入了一個(gè)靈活的連接器。此外,為了分離TINCR lncRNA和pTINCR微蛋白的功能,我們還通過(guò)突變約20%的pTINCR-HA核苷酸序列,開(kāi)發(fā)了一個(gè)合成的ORF (syORF),在生產(chǎn)相同的蛋白質(zhì)的同時(shí)顯著改變了RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。我們?cè)谡麄€(gè)手稿中使用syORF來(lái)驗(yàn)證我們的主要發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)圖圖例)。在U2OS中瞬時(shí)表達(dá)時(shí)檢測(cè)到C-和N-末端結(jié)構(gòu),并顯示出類似的分布,在所有細(xì)胞組分中均可檢測(cè)到,但最顯著的是在細(xì)胞核和細(xì)胞間連接處,與蛋白質(zhì)的內(nèi)源性定位一致(圖1k)。

 

 

(3) 體外上皮分化需要pTINCR

我們使HaCaT和MCF7細(xì)胞都受到高鈣的作用,高鈣是一種眾所周知的表皮分化誘導(dǎo)劑50,同時(shí)也是其他上皮組織如食管或乳腺的分化誘導(dǎo)劑。WTMCF7細(xì)胞(圖4a) O n, p t I n C R p R O e x p R s n n t M cf7細(xì)胞(圖4a)。重要的是,我們觀察到在WT和pTINCR-KO細(xì)胞中,TINCR lncRNA在鈣誘導(dǎo)的分化過(guò)程中有相同程度的上調(diào)(圖4b),表明在工程pTINCR-KO細(xì)胞中,TINCR lncRNA的調(diào)控不受影響。然而,ptincro缺陷細(xì)胞無(wú)法像WT細(xì)胞一樣上調(diào)分化標(biāo)志物(圖4c, f)。此外,pTINCRKO細(xì)胞在分化條件下沒(méi)有獲得上皮形態(tài)(圖4d, g),也沒(méi)有重塑其肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架向皮層傾向(圖4e, h)。這些結(jié)果表明,pTINCR蛋白獨(dú)立于TINCR lncRNA,在體外實(shí)現(xiàn)完全上皮分化是必需的。

 

 

(4) pTINCR觸發(fā)上皮分化轉(zhuǎn)錄程序

為了證實(shí)pTINCR的促分化功能,我們分析了pTINCR過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄譜。我們?cè)趐TINCR過(guò)表達(dá)的hSCC10細(xì)胞系中進(jìn)行了廣泛的RNA-seq分析,以評(píng)估早期轉(zhuǎn)錄組變化(6、12和24小時(shí))和長(zhǎng)期變化(4、7、14和21天),后者可能反映了細(xì)胞特性的變化。首先,我們使用脈沖算法研究了pTINCR過(guò)表達(dá)驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué),脈沖算法是縱向測(cè)序?qū)嶒?yàn)的框架,揭示了與time54相關(guān)的差異基因表達(dá)。我們檢測(cè)到6組不同的基因,根據(jù)它們的動(dòng)態(tài)表達(dá)聚集在一起(圖5a, b)。我們對(duì)每個(gè)聚類進(jìn)行了基因本體富集分析(圖5c, d)。有趣的是,其中兩個(gè)簇1和簇2是動(dòng)態(tài)對(duì)立的簇,都豐富了與細(xì)胞骨架相關(guān)的基因本體術(shù)語(yǔ)。

 

 

(5) pTINCR在細(xì)胞應(yīng)激時(shí)以p53依賴的方式上調(diào),是損傷誘導(dǎo)分化所必需的

pTINCR過(guò)表達(dá)21天后,其他上皮特異性的信號(hào)(“上皮細(xì)胞分化”、“細(xì)胞-細(xì)胞連接”、“上皮細(xì)胞-細(xì)胞粘附”、“頂端表面”、“Notch信號(hào)”)和表皮相關(guān)的信號(hào)(“表皮細(xì)胞分化”、“皮膚發(fā)育”、“角化細(xì)胞分化”、“角化”)也會(huì)發(fā)生變化(圖5g, h)。與pTINCR表達(dá)負(fù)相關(guān)的基因集在與細(xì)胞周期、細(xì)胞代謝和蛋白質(zhì)加工等相關(guān)的通路中富集(圖5g)。有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)ptincr下調(diào)基因也富集在“Myc靶點(diǎn)”的信號(hào)區(qū),這是cSCC中的一種致癌途徑,與腫瘤的分化級(jí)別和該惡性腫瘤的臨床預(yù)后密切相關(guān)44,56,57。我們通過(guò)RT-qPCR分析驗(yàn)證了這些結(jié)果。總之,該轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究強(qiáng)烈支持我們的功能研究揭示的pTINCR促分化功能。

 

 

(6) pTINCR在上皮性腫瘤中具有抑瘤活性

眾所周知,P53是一種腫瘤抑制因子,在50%以上的人類癌癥中都發(fā)生了突變。此外,越來(lái)越多的證據(jù)表明p53也參與胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化58,59。我們之前的研究結(jié)果表明,考慮到HaCaT細(xì)胞是p53突變體,pTINCR在鈣誘導(dǎo)分化中的作用不需要功能p53??紤]到在上皮組織中,細(xì)胞損傷會(huì)激活末端分化程序36,37,我們想知道pTINCR的表達(dá)是否與損傷時(shí)p53的激活有關(guān)。首先,我們用幾種p53誘導(dǎo)劑或穩(wěn)定劑(阿霉素、放線菌素- d或nutlin-3a)處理不同的癌細(xì)胞系,并分析TINCR表達(dá)和pTINCR水平。我們觀察到,只有p53功能正常(A549或HCT116)的細(xì)胞在mRNA和蛋白水平上調(diào)了pTINCR,而p53- ko細(xì)胞(HCT116 p53KO)或p53突變(hSCC10)沒(méi)有表現(xiàn)出相同的反應(yīng)(圖6a, b)。

這些結(jié)果證實(shí)了pTINCR在應(yīng)激中以p53依賴的方式上調(diào)。我們分析了已發(fā)表的p53 ChIP-seq實(shí)驗(yàn)60,61,我們沒(méi)有觀察到p53與pTINCR位點(diǎn)結(jié)合,無(wú)論是在對(duì)照組細(xì)胞中還是在使用dna損傷劑處理的細(xì)胞中,這表明p53對(duì)pTINCR的調(diào)控是間接的。接下來(lái),我們使用pTINCR- ko MCF7細(xì)胞系研究了pTINCR缺乏對(duì)p53依賴性dna損傷誘導(dǎo)分化的影響。MCF7細(xì)胞是p53 WT,正如預(yù)期的那樣,在pTINCR-WT和pTINCR-KO細(xì)胞中,TINCR轉(zhuǎn)錄水平在損傷后上調(diào)(圖6c)。

 

 

結(jié)論:

總之,我們揭示了pTINCR是一種以前被忽視的UBL-微蛋白,它調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的識(shí)別并顯示出腫瘤抑制活性(圖10)。pTINCR作為一種假設(shè)lncRNA的生物活性產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn),促進(jìn)了由lncRNA編碼的微蛋白所代表的額外調(diào)控水平的想法。對(duì)微蛋白質(zhì)組的探索可以為調(diào)控生理和病理過(guò)程(如癌癥)提供新的細(xì)胞識(shí)別調(diào)節(jié)因子。

 

參考文獻(xiàn):

Boix, O., Martinez, M., Vidal, S., Giménez-Alejandre, M., Palenzuela, L., Lorenzo-Sanz, L., Quevedo, L., Moscoso, O., Ruiz-Orera, J., Ximénez-Embún, P., Ciriaco, N., Nuciforo, P., Stephan-Otto Attolini, C., Albà, M. M., Mu?oz, J., Tian, T. V., Varela, I., Vivancos, A., Ramón Y Cajal, S., Mu?oz, P., … Abad, M. (2022). pTINCR microprotein promotes epithelial differentiation and suppresses tumor growth through CDC42 SUMOylation and activation. Nature communications, 13(1), 6840. https://doi.org/10.1038/s41467-022-34529-6.