pTINCR微蛋白通過CDC42 SUMO化和激活促進(jìn)上皮分化，抑制腫瘤生長

人類轉(zhuǎn)錄組包含數(shù)千個(gè)小的開放閱讀框(sorf)，它們編碼的微蛋白的功能在很大程度上仍未被探索。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TINCR lncRNA編碼pTINCR, pTINCR是一種進(jìn)化保守的泛素樣蛋白(UBL)，在許多上皮細(xì)胞中表達(dá)，在分化和細(xì)胞應(yīng)激下表達(dá)上調(diào)。通過功能獲得和功能喪失的研究，我們證明了pTINCR是體外和體內(nèi)上皮分化的一個(gè)關(guān)鍵誘導(dǎo)因子。有趣的是，在幾種上皮性癌癥中，TINCR的低表達(dá)與較差的預(yù)后相關(guān)，而pTINCR的過表達(dá)降低了患者源性異種移植瘤的惡性程度。在分子水平上，pTINCR通過SUMO相互作用motif (SIM)與SUMO結(jié)合，并與CDC42結(jié)合，CDC42是一種RhoGTPase，對肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑和上皮分化至關(guān)重要。此外，pTINCR增加CDC42的sumo化并促進(jìn)其激活，觸發(fā)促分化級聯(lián)反應(yīng)。我們的研究結(jié)果表明，微蛋白質(zhì)組是與癌癥相關(guān)的細(xì)胞身份的新調(diào)控源。本文于2022年11月11日發(fā)表于Nature Communications(IF=17.694)。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果:

(1) pTINCR是由TINCR lncRNA編碼的一種保守微蛋白，在上皮組織中表達(dá)

TINCR是角化細(xì)胞和其他上皮細(xì)胞分化過程中上調(diào)的3.7千堿基lncRNA 40 - 42。我們證實(shí)了TINCR在人和小鼠皮膚中表達(dá)，也在其他上皮細(xì)胞中表達(dá)(圖1b)。對TINCR轉(zhuǎn)錄本的保守分析顯示sORF為264 bp(圖1c)。小鼠皮膚核糖體譜分析(RibORF評分≥0.7)顯示，該sORF被翻譯成一種高度保守的具有87個(gè)氨基酸的微蛋白，我們將其命名為pTINCR(圖1c, d)。為了確認(rèn)pTINCR sORF被翻譯成一種穩(wěn)定的微蛋白，我們在35s -蛋氨酸存在的情況下，使用全長TINCR lncRNA (integrl: ENST00000448587.5)進(jìn)行了體外翻譯(圖1e, f)，并獲得了約12 kDa的肽產(chǎn)物。值得注意的是，突變pTINCR的起始密碼子會(huì)損害任何可檢測產(chǎn)物的翻譯(圖1e, f)。

(2) pTINCR促進(jìn)體外和體內(nèi)上皮分化

為了表征pTINCR的細(xì)胞和分子功能，我們在強(qiáng)力環(huán)素誘導(dǎo)的慢病毒載體中克隆了標(biāo)記HA表位的pTINCR sORF。我們生成了兩種不同的結(jié)構(gòu)，將ha標(biāo)記放置在微蛋白的c端(pTINCR-HA)或n端(HA-pTINCR)部分。為了最大限度地減少標(biāo)簽對pTINCR的可能影響，我們在HA和pTINCR sORF之間引入了一個(gè)靈活的連接器。此外，為了分離TINCR lncRNA和pTINCR微蛋白的功能，我們還通過突變約20%的pTINCR-HA核苷酸序列，開發(fā)了一個(gè)合成的ORF (syORF)，在生產(chǎn)相同的蛋白質(zhì)的同時(shí)顯著改變了RNA的二級結(jié)構(gòu)。我們在整個(gè)手稿中使用syORF來驗(yàn)證我們的主要發(fā)現(xiàn)(見圖圖例)。在U2OS中瞬時(shí)表達(dá)時(shí)檢測到C-和N-末端結(jié)構(gòu)，并顯示出類似的分布，在所有細(xì)胞組分中均可檢測到，但最顯著的是在細(xì)胞核和細(xì)胞間連接處，與蛋白質(zhì)的內(nèi)源性定位一致(圖1k)。

(3) 體外上皮分化需要pTINCR

我們使HaCaT和MCF7細(xì)胞都受到高鈣的作用，高鈣是一種眾所周知的表皮分化誘導(dǎo)劑50，同時(shí)也是其他上皮組織如食管或乳腺的分化誘導(dǎo)劑。WTMCF7細(xì)胞(圖4a) O n, p t I n C R p R O e x p R s n n t M cf7細(xì)胞(圖4a)。重要的是，我們觀察到在WT和pTINCR-KO細(xì)胞中，TINCR lncRNA在鈣誘導(dǎo)的分化過程中有相同程度的上調(diào)(圖4b)，表明在工程pTINCR-KO細(xì)胞中，TINCR lncRNA的調(diào)控不受影響。然而，ptincro缺陷細(xì)胞無法像WT細(xì)胞一樣上調(diào)分化標(biāo)志物(圖4c, f)。此外，pTINCRKO細(xì)胞在分化條件下沒有獲得上皮形態(tài)(圖4d, g)，也沒有重塑其肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架向皮層傾向(圖4e, h)。這些結(jié)果表明，pTINCR蛋白獨(dú)立于TINCR lncRNA，在體外實(shí)現(xiàn)完全上皮分化是必需的。

(4) pTINCR觸發(fā)上皮分化轉(zhuǎn)錄程序

為了證實(shí)pTINCR的促分化功能，我們分析了pTINCR過表達(dá)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄譜。我們在pTINCR過表達(dá)的hSCC10細(xì)胞系中進(jìn)行了廣泛的RNA-seq分析，以評估早期轉(zhuǎn)錄組變化(6、12和24小時(shí))和長期變化(4、7、14和21天)，后者可能反映了細(xì)胞特性的變化。首先，我們使用脈沖算法研究了pTINCR過表達(dá)驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)，脈沖算法是縱向測序?qū)嶒?yàn)的框架，揭示了與time54相關(guān)的差異基因表達(dá)。我們檢測到6組不同的基因，根據(jù)它們的動(dòng)態(tài)表達(dá)聚集在一起(圖5a, b)。我們對每個(gè)聚類進(jìn)行了基因本體富集分析(圖5c, d)。有趣的是，其中兩個(gè)簇1和簇2是動(dòng)態(tài)對立的簇，都豐富了與細(xì)胞骨架相關(guān)的基因本體術(shù)語。

(5) pTINCR在細(xì)胞應(yīng)激時(shí)以p53依賴的方式上調(diào)，是損傷誘導(dǎo)分化所必需的

pTINCR過表達(dá)21天后，其他上皮特異性的信號(“上皮細(xì)胞分化”、“細(xì)胞-細(xì)胞連接”、“上皮細(xì)胞-細(xì)胞粘附”、“頂端表面”、“Notch信號”)和表皮相關(guān)的信號(“表皮細(xì)胞分化”、“皮膚發(fā)育”、“角化細(xì)胞分化”、“角化”)也會(huì)發(fā)生變化(圖5g, h)。與pTINCR表達(dá)負(fù)相關(guān)的基因集在與細(xì)胞周期、細(xì)胞代謝和蛋白質(zhì)加工等相關(guān)的通路中富集(圖5g)。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)ptincr下調(diào)基因也富集在“Myc靶點(diǎn)”的信號區(qū)，這是cSCC中的一種致癌途徑，與腫瘤的分化級別和該惡性腫瘤的臨床預(yù)后密切相關(guān)44,56,57。我們通過RT-qPCR分析驗(yàn)證了這些結(jié)果?？傊撧D(zhuǎn)錄組學(xué)研究強(qiáng)烈支持我們的功能研究揭示的pTINCR促分化功能。

(6) pTINCR在上皮性腫瘤中具有抑瘤活性

眾所周知，P53是一種腫瘤抑制因子，在50%以上的人類癌癥中都發(fā)生了突變。此外，越來越多的證據(jù)表明p53也參與胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化58,59。我們之前的研究結(jié)果表明，考慮到HaCaT細(xì)胞是p53突變體，pTINCR在鈣誘導(dǎo)分化中的作用不需要功能p53。考慮到在上皮組織中，細(xì)胞損傷會(huì)激活末端分化程序36,37，我們想知道pTINCR的表達(dá)是否與損傷時(shí)p53的激活有關(guān)。首先，我們用幾種p53誘導(dǎo)劑或穩(wěn)定劑(阿霉素、放線菌素- d或nutlin-3a)處理不同的癌細(xì)胞系，并分析TINCR表達(dá)和pTINCR水平。我們觀察到，只有p53功能正常(A549或HCT116)的細(xì)胞在mRNA和蛋白水平上調(diào)了pTINCR，而p53- ko細(xì)胞(HCT116 p53KO)或p53突變(hSCC10)沒有表現(xiàn)出相同的反應(yīng)(圖6a, b)。

這些結(jié)果證實(shí)了pTINCR在應(yīng)激中以p53依賴的方式上調(diào)。我們分析了已發(fā)表的p53 ChIP-seq實(shí)驗(yàn)60,61，我們沒有觀察到p53與pTINCR位點(diǎn)結(jié)合，無論是在對照組細(xì)胞中還是在使用dna損傷劑處理的細(xì)胞中，這表明p53對pTINCR的調(diào)控是間接的。接下來，我們使用pTINCR- ko MCF7細(xì)胞系研究了pTINCR缺乏對p53依賴性dna損傷誘導(dǎo)分化的影響。MCF7細(xì)胞是p53 WT，正如預(yù)期的那樣，在pTINCR-WT和pTINCR-KO細(xì)胞中，TINCR轉(zhuǎn)錄水平在損傷后上調(diào)(圖6c)。

結(jié)論：

總之，我們揭示了pTINCR是一種以前被忽視的UBL-微蛋白，它調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的識別并顯示出腫瘤抑制活性(圖10)。pTINCR作為一種假設(shè)lncRNA的生物活性產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)了由lncRNA編碼的微蛋白所代表的額外調(diào)控水平的想法。對微蛋白質(zhì)組的探索可以為調(diào)控生理和病理過程(如癌癥)提供新的細(xì)胞識別調(diào)節(jié)因子。

參考文獻(xiàn)：

Boix, O., Martinez, M., Vidal, S., Giménez-Alejandre, M., Palenzuela, L., Lorenzo-Sanz, L., Quevedo, L., Moscoso, O., Ruiz-Orera, J., Ximénez-Embún, P., Ciriaco, N., Nuciforo, P., Stephan-Otto Attolini, C., Albà, M. M., Mu?oz, J., Tian, T. V., Varela, I., Vivancos, A., Ramón Y Cajal, S., Mu?oz, P., … Abad, M. (2022). pTINCR microprotein promotes epithelial differentiation and suppresses tumor growth through CDC42 SUMOylation and activation. Nature communications, 13(1), 6840. https://doi.org/10.1038/s41467-022-34529-6.