基于全轉(zhuǎn)錄組測序分析淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)探索三陰性乳腺癌的發(fā)病機制和治療靶點

三陰性乳腺癌（TNBC）約占全球乳腺癌診斷總發(fā)病率的15%，預(yù)后相對不利。對于TNBC患者，局部或區(qū)域復(fù)發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移和死亡的風險在診斷后約2-3年達到高峰，TNBC似乎更可能轉(zhuǎn)移到內(nèi)臟器官，如肝、肺和腦。特別是，TNBC患者的腋窩淋巴結(jié)（ALNs）轉(zhuǎn)移是一個強有力的獨立預(yù)后因素，表明5年生存率較差。此外，與淋巴結(jié)陰性患者相比，微轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)受累與死亡風險增加相關(guān)。然而，ALN轉(zhuǎn)移的潛在確切機制尚不清楚。該研究發(fā)表于《Journal of Translational Medicine》，IF: 8.44。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

首先，為了鑒定潛在的ALN轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNA、circRNA和mRNA，對三對ALN陽性和ALN陰性TNBC組織進行了全轉(zhuǎn)錄組測序（WTS）。作者總共鑒定了739個mRNA，206個circRNA和110個miRNA，它們以熱圖的形式呈現(xiàn)（圖1）。

圖1 ALN陽性和ALN陰性TNBC患者之間差異表達RNA的熱圖

簡而言之，鑒定出206個DEC，包括41個上調(diào)和165個下調(diào)的circRNA（圖2A）。共鑒定出110個DEMi，其中53個上調(diào)miRNA和57個下調(diào)miRNA（圖2B）。同時，在739個DEM中，371個mRNA過表達，368個mRNA下調(diào)（圖2C）。

圖2 ALN陽性和ALN陰性TNBC患者之間差異表達RNA的火山圖

然后，對DEM進行了功能富集分析。通過clusterProfiler（版本3.14.3）進行KEGG通路分析以識別顯著富集的通路。具體而言，DEMs主要富集于TGF-β信號通路、藥物代謝-細胞色素P450通路、細胞周期、p53信號通路、乳腺癌、TNF信號通路、IL-17信號通路和河馬信號通路（圖3A）。此外，還進行了標志性基因分析，以使用clusterProfiler基于分子特征數(shù)據(jù)庫確定有意義的途徑。DEM主要參與E2F靶標、缺口信號傳導(dǎo)、血管生成、G2M檢查點、糖酵解、早期雌激素反應(yīng)、晚期雌激素反應(yīng)和IL2 STAT5信號傳導(dǎo)（圖3B）。在這些通路中，TNF信號通路、細胞周期、p53信號通路、乳腺癌和NOTCH信號通路與TNBC的致癌作用和進展有關(guān)。

圖3 DEM的功能富集分析

接下來，為了探索DEC和DEMis在TNBC的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的潛在重要作用，作者構(gòu)建了一個circRNA-miRNA\u2012mRNA（ceRNA）網(wǎng)絡(luò)。首先，作者提取了從RNA-seq數(shù)據(jù)中選擇的八個排名靠前的DEC（hsa_circRNA_061260，hsa_circRNA_060876，hsa_circRNA_046265，hsa_circRNA_087060，hsa_circRNA_007336，hsa_circRNA_007333，hsa_circRNA_044837和hsa_circRNA_000150）相關(guān)的數(shù)據(jù)。然后，作者使用circBank和CircInteractome在線數(shù)據(jù)集篩選了八個DEC靶向的潛在miRNA，并將它們與已鑒定的DEMi重疊。結(jié)果，產(chǎn)生了由8個DEC和6個DEMi（has-miR-1207-5p，has-miR-4763-3p，has-miR-326，has-miR-885-3p，has-miR-5000-3p和has-miR-4792）組成的circRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)。隨后，利用miRTarBase和TargetScan來識別這6個DEMi靶向的mRNA。接下來，將靶向mRNA與先前確定的DEM進行交叉檢查，并識別出18個DEM。最后，作者使用Cytoscape 3.7.1在TNBC中建立了一個包含8個DECs，6個DEMi和18個DEMs的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖4）。

圖4 TNBC中circRNA-miRNA-mRNA的ALN轉(zhuǎn)移相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)

下一步是對相關(guān)的DEM進行生存分析。為了研究DEMs的表達及其在BC中的預(yù)后價值，作者從Kaplan\u2012Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中檢索了臨床樣品的mRNA表達譜數(shù)據(jù)以及相應(yīng)的總生存期（OS）和無復(fù)發(fā)生存期（RFS）數(shù)據(jù)。然后，對來自ceRNA網(wǎng)絡(luò)的18個DEM進行存活分析。RAB3D和EDARADD與OS顯著相關(guān)，GSR與BC患者的RFS顯著相關(guān)（圖5）。RAB3D和EDARADD的高表達水平預(yù)示著更好的OS。同時，GSR的高表達水平預(yù)示著更好的RFS。因此，這3種mRNA及其對應(yīng)的基因最有可能成為通過TNBC中ceRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控DEC的靶基因。

圖5 ceRNA網(wǎng)絡(luò)中生存相關(guān)差異表達的mRNA的Kaplan\u2012Meier曲線

根據(jù)生存相關(guān)DEM的結(jié)果，作者確定了與生存結(jié)果相關(guān)的相應(yīng)基因。三個已鑒定的基因（RAB3D，EDARADD和GSR）可能是TNBC預(yù)后的重要生物標志物。然后，作者基于這些th-ree基因構(gòu)建了一個與生存相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。如圖6所示，鑒定了包含兩個DEC（hsa_circRNA_061260和hsa_circRNA_060876）、兩個DEMIS（has-miR-5000-3p 和 has-miR-4792）和三個 mRNA（GSR、RAB3D 和 EDARADD）的三個ceRNA調(diào)控軸。來自生存相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)的這些調(diào)節(jié)模塊包括hsa_circRNA_060876 / hsa-miR-4792 / GSR調(diào)控軸、hsa_circRNA_060876 / hsa-miR-4792 / RAB3D調(diào)控軸和hsa_circRNA_061260 / hsa-miR-5000-3p / EDARADD調(diào)控軸。

圖6 TNBC中與生存相關(guān)的circRNA-miRNA\uu2012mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

最后，為了驗證TNBC細胞中可能失調(diào)的候選DEC的結(jié)果，作者首先在以下細胞系中進行RT\u2012qPCR：MCF-10 A，MDA-MB-231和MDA-MB-453。作者選擇了兩個DEC進行進一步分析，并進行了Sanger測序，以確認這兩個DEC獨特的反向拼接連接位點（圖7A-B）。DEC hsa_circRNA_061260位于chr21：11，047，480–11，049，621，由外顯子4和外顯子5組成。DEC hsa_circRNA_060876位于chr20：50，226，639–50，292，747，由外顯子10至24組成。PCR結(jié)果顯示，與MCF-10 A細胞系相比，MDA-MB-231和MDA-MB-453細胞系中hsa_circRNA_061260和hsa_circRNA_060876的表達水平均下調(diào)（p <0.01; 圖7C-D）。

圖7 有關(guān)circRNA及其反向拼接連接位點的詳細信息

結(jié)論：

該研究利用WTS研究了TNBC中ALN轉(zhuǎn)移的分子機制。建立了生存相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，確定了兩種新型DEC作為TNBC中ALN轉(zhuǎn)移的可能預(yù)后預(yù)測因子和潛在治療靶點。這些發(fā)現(xiàn)為闡明TNBCALN轉(zhuǎn)移的機制、實現(xiàn)早期診斷和確定治療靶點提供了新的思路。

參考文獻：

Luo J, Cao D, Hu C, Liang Z, Zhang Y, Lai J. Lymphatic metastasis-associated circRNA?miRNA?mRNA network for exploring the pathogenesis and therapeutic target of triple negative breast cancer based on whole-transcriptome sequencing analysis: an experimental verification study. J Transl Med. 2022 Nov 5;20(1):508. doi: 10.1186/s12967-022-03728-6.