脂肪多糖衍生亞油酸促進(jìn)米色脂肪祖細(xì)胞增殖
新生米色脂肪細(xì)胞的生物發(fā)生涉及白色脂肪組織（WAT）中祖細(xì)胞的增殖；然而，是什么調(diào)控了這一過程仍不清楚。在這里，本演技報(bào)告了在小鼠模型和人類組織中，WAT脂解衍生的亞油酸在冷適應(yīng)、b3-AR激活和燒傷后觸發(fā)米色祖細(xì)胞增殖。細(xì)胞表面標(biāo)記物PDGFRa或Sca1和CD81標(biāo)記的脂肪祖細(xì)胞亞群含有豐富的嵴線粒體，并通過脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CD36主動(dòng)輸入亞油酸?？诜a(bǔ)充亞油酸，即使在熱中性條件下以CD36依賴的方式刺激米色祖細(xì)胞增殖?？傊狙芯拷Y(jié)果為多樣化的病理生理提供機(jī)制性的見解。本研究于2022年12月發(fā)表于期刊《Developmental cell》上，IF：1.417。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1冷刺激和b3-AR刺激誘導(dǎo)小鼠和人的CD81+細(xì)胞增殖
作者建立在他莫昔芬處理后的CD81 +細(xì)胞中選擇性缺乏脂肪生成主要調(diào)節(jié)因子PPARg的小鼠。為此，作者在PpargCD81 KO小鼠中建立了他莫昔芬治療后在CD81 +細(xì)胞中選擇性缺乏脂肪生成的主要調(diào)節(jié)因子PPARg的小鼠（圖1A）。小鼠在30℃下接受他莫昔芬治療，隨后適應(yīng)8℃。冷刺激下，對照組小鼠（Ppargflox/flox）在腹股溝WAT（白色脂肪組織）的前、中、后區(qū)有大量表達(dá)UCP1（解偶聯(lián)蛋白1）的多室脂肪細(xì)胞簇，這是米色脂肪細(xì)胞的一個(gè)形態(tài)學(xué)特征（圖1B）。相比之下，PpargCD81 KO小鼠腹股溝WAT在冷刺激下白色脂肪組織大大受損（圖1B）。與形態(tài)學(xué)變化一致，PpargCD81 KO小鼠腹股溝WAT中棕色/米色脂肪選擇基因UCP1、Pgc1a、Cidea和Elovl3的表達(dá)水平明顯低于對照組小鼠（圖1C）。這些結(jié)果說明大量冷刺激誘導(dǎo)下的白色脂肪組織起源于小鼠腹股溝WATCD81+祖細(xì)胞（APC）。作者發(fā)現(xiàn)腹股溝WAT中CD81 +APC（Lin- : Sca1 + : CD81 + : Ki67 +）在冷暴露3天內(nèi)Ki67 +細(xì)胞群數(shù)量顯著增加（圖1D）。用CD81-lineage reporter小鼠進(jìn)行組織學(xué)分析也表明腹股溝WAT的基質(zhì)細(xì)胞共表達(dá)GFP和Ki67，Ki67+ GFP+細(xì)胞的數(shù)量在冷刺激下顯著增長（圖1E-F）。除了冷刺激，用b3-AR治療3天，相較于載體處理小鼠WAT，治療后小鼠腹股溝WAT中Ki67+和CD81+細(xì)胞增多（圖1G）。FACS（熒光激活細(xì)胞分選術(shù)）定量地檢測來自活檢組織Lin svf中Ki67+和CD81+細(xì)胞的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)CL316,243在體外培養(yǎng)的小鼠腹股溝WAT中以劑量依賴的方式顯著增加Ki67+和CD81+細(xì)胞的數(shù)量（圖1I）。在人WAT中b3-AR治療也顯著增加Ki67+和CD81+細(xì)胞的數(shù)量，盡管處于非刺激下的Ki67+和CD81+細(xì)胞數(shù)量與個(gè)體之間的有所不同（圖1J）。
圖1 冷刺激和b3-AR刺激誘導(dǎo)CD81+APC增殖
根據(jù)在小鼠中建立的方案，在燒傷和假手術(shù)處理后，作者將獲得腹股溝WAT 1天、3天和7天的C57BL/6J小鼠（圖2A）。燒傷后3天和7天血漿游離脂肪酸（FAA）水平明顯高于對照組小鼠（圖2B）。燒傷后7天，受傷小鼠腹股溝WAT各區(qū)域均有大量多房型米色脂肪細(xì)胞，其中大部分表達(dá)UCP1蛋白（圖2C）。與對照組小鼠相比，在燒傷后7天，形態(tài)變化伴隨著棕/米色選擇基因的表達(dá)增加，如Ucp1、Elovl3、Dio2和Cox8b（圖2D）。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)在燒傷3天和7天后，小鼠腹股溝WAT中Ki67+CD81+細(xì)胞顯著增多（圖2E-F）。這些結(jié)果表明米色脂肪發(fā)生的病理刺激包括WAT中CD81+祖細(xì)胞的增殖。
圖2 燒傷促進(jìn)CD81+ APC細(xì)胞增殖
3、脂肪分解是米色脂肪細(xì)胞增殖所必需的
為驗(yàn)證猜想WAT脂肪多聚物衍生因子介導(dǎo)米色祖細(xì)胞的增殖，作者使用缺乏脂肪肝三酯脂肪酶（ATGL）小鼠，即Adipo-ATGL KO小鼠。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，Adipo-ATGL KO小鼠和它的同窩出生的小鼠在30℃下生存14天，隨后8℃下生存3天（圖3A-B）。
冷馴化3天后，對照組小鼠腹溝WAT庫的組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)大量米黃色脂肪細(xì)胞，多房脂質(zhì)和UCP1表達(dá)，特別是在中間區(qū)域。相反，在AdipoATGL KO小鼠中，冷誘導(dǎo)的米色脂肪細(xì)胞的生物生成幾乎完全消失（圖3C）。此外，adipocyte-specificATGL缺失顯著降低了在腹股溝WAT中棕色/米色脂肪選擇基因的表達(dá)，包括Ucp1、Pgc1a、Cidea、Dio2、Cox8b和Prdm16（圖3D）。
接著FACS檢測30C和冷馴化后小鼠腹股溝WAT中CD81+細(xì)胞的增殖。30℃時(shí)，Ki67+ CD81+細(xì)胞數(shù)量在基因型間無差異。冷馴化顯著增加對照組小鼠Ki67+ CD81+細(xì)胞數(shù)量；然而，這種冷誘導(dǎo)的米色祖細(xì)胞增殖在Adipo-ATGL KO小鼠中完全消失（圖3E）。當(dāng)CL316243處理體外培養(yǎng)的腹股溝WAT時(shí)，觀察到對照小鼠來源的WAT庫中的CD81+ Ki67+細(xì)胞的數(shù)量顯著增加。相比之下，CL316243在AdipoATGL KO小鼠中的刺激作用減弱（圖3F）。與遺傳學(xué)研究一致的是，Atglistatin對ATGL的藥理抑制有效的阻斷CL316243對野生型小鼠腹股溝WAT中CD81+細(xì)胞增殖的刺激（圖3G）。
圖3 CD81+ APC細(xì)胞增殖需要脂解作用
4、亞油酸刺激米色脂肪祖細(xì)胞增殖
作者下面鑒定脂質(zhì)分解因素介導(dǎo)的米色脂肪細(xì)胞增殖（圖4A）。煮沸培養(yǎng)基中的脂質(zhì)提取物能夠刺激CD81+細(xì)胞增殖（圖4B）。隨后，作者基于前人的數(shù)據(jù)庫和質(zhì)譜循環(huán)分析證明了冷刺激和b3-AR治療都能持續(xù)的增加，如圖4C所示的6種脂肪酸。補(bǔ)充亞油酸顯著刺激CD81+細(xì)胞的增殖，而其他細(xì)胞沒有明顯變化（圖4D）。亞油酸處理通過增加S期和G2-M期細(xì)胞數(shù)量促進(jìn)細(xì)胞增殖，CD81+細(xì)胞優(yōu)先增殖（圖4E）。同時(shí)，作者也發(fā)現(xiàn)是亞油酸，而不是a亞麻酸或反亞麻酸，亞油酸的幾何異構(gòu)體促進(jìn)CD81+細(xì)胞增殖（圖4F）。為檢測口服亞油酸是否促進(jìn)體內(nèi)米色細(xì)胞增殖，野生型雄性小鼠在30℃條件下，每天攝入濃度為1%的亞油酸（圖4G）。FACS檢測發(fā)現(xiàn)口服亞油酸可使小鼠體內(nèi)Ki67+ CD81+細(xì)胞顯著增加3倍（圖4H）。盡管8℃的冷刺激會促使處理過的小鼠米色脂肪的生物生成，但是補(bǔ)充亞油酸進(jìn)一步促進(jìn)小鼠米色脂肪的生物生成（圖4I）。作者發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充亞油酸增強(qiáng)腹股溝WAT中CD81+細(xì)胞米色脂肪的生成（圖4J）。作者發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充亞油酸可以有效刺激對照組中小鼠腹股溝WAT中米色脂肪的生成，而在PpargCD81 KO小鼠中這種作用明顯減弱（圖4K）。與分子分析一致的是，腹股溝WAT的組織學(xué)分析顯示PpargCD81KO小鼠的多房米色脂肪細(xì)胞比對照組少（圖4L）。這些結(jié)果表明，當(dāng)補(bǔ)充亞油酸和冷刺激結(jié)合時(shí)，增強(qiáng)CD81+細(xì)胞來源的新生米色脂肪的生物生成。
圖4 亞油酸刺激CD81+APC增殖
5、米色脂肪祖細(xì)胞中活躍的線粒體代謝和花生四烯酸通路
為探索亞油酸刺激米色祖細(xì)胞增的機(jī)制，作者對腹股溝WAT中原生CD81+和CD81-細(xì)胞進(jìn)行RNA測序。與之前的分析一致，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，與CD81-細(xì)胞相比，CD81+細(xì)胞表達(dá)出高水平的平滑肌基因富集，包括Acta2、Sm22和Myh11（圖5A）。值得注意的是，CD81+細(xì)胞表達(dá)的線粒體編碼基因，如Atp6、Atp8、Cox1、Cox2和Cytb，明顯高于來自腹股溝WAT的CD81-細(xì)胞（圖5A）。電子顯微鏡（EM）中發(fā)現(xiàn)CD81+細(xì)胞中含有大量的線粒體，其中許多線粒體呈球形或橢圓形，并平行于致密嵴，表現(xiàn)出棕色前脂肪細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征（圖5B）。此外，CD81+細(xì)胞的耗氧率明顯高于基礎(chǔ)狀態(tài)和羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）處理后的CD81細(xì)胞（圖5C）。補(bǔ)充亞油酸通過增強(qiáng)FA氧化進(jìn)一步激活CD81 +細(xì)胞的生物能量學(xué)，因?yàn)槿鈮A棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（CPT）抑制劑（乙莫克害）抑制FA氧化減弱亞油酸對細(xì)胞呼吸的刺激作用（圖5D）。
從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)CD81+細(xì)胞與CD81細(xì)胞相比，花生四烯酸合成途徑高度富集（圖5E）。接下來，脂質(zhì)組學(xué)檢測暴露8℃ 3天的小鼠原代CD81+和CD81-細(xì)胞中前列腺素的水平。分析發(fā)現(xiàn)PGD2在CD81+細(xì)胞中的水平顯著高于CD81-細(xì)胞（圖5F）。隨后，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS / MS）定量CD81+細(xì)胞中PGD2的含量以及釋放到培養(yǎng)基中的PGD2水平，發(fā)現(xiàn)抑制Cox2顯著降低PGD2的細(xì)胞水平和釋放水平（圖5G），表明Cox2是CD81+細(xì)胞合成PGD2所必需的。Cox1、Alox5和Alox12的抑制劑不干擾亞油酸的作用（圖5H）。其次，鑒于CD81+細(xì)胞表達(dá)高水平的前列腺素受體，如DP1，作者確定PGD2直接作用于米色祖細(xì)胞的程度。另外還發(fā)現(xiàn)PGD2可以顯著促進(jìn)CD81+細(xì)胞的增殖，而DP1的特異性抑制劑MK-0524可以阻斷PGD2的促增殖作用（圖5I）。冷暴露顯著增加腹股溝WAT中Ki67 + CD81 +細(xì)胞的數(shù)量；然而，Cox2抑制劑處理顯著減弱冷暴露對CD81 +祖細(xì)胞增殖的刺激作用（圖5J）。這些結(jié)果表明脂解衍生的亞油酸被線粒體中的CD81 +祖細(xì)胞氧化，并通過Cox2途徑用于PGD2的合成。
圖5 CD81+在線粒體代謝和花生四烯酸途徑中富集
為解決米色祖細(xì)胞如何攝取亞油酸，作者首先在腹股溝WAT中尋找CD81+米色祖細(xì)胞相對于CD81-細(xì)胞高表達(dá)的細(xì)胞膜蛋白。轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)鑒定出多個(gè)候選基因，包括Slc7a2（或稱為Cat2）、Tmem37和Cd36（圖6A）。
作者用qPCR（圖6B）和CD36抗體（圖6C）在獨(dú)立樣本中驗(yàn)證CD36與CD81、整合素b1或b2和SRC家族激酶類形成異源復(fù)合物，驅(qū)動(dòng)CD36的內(nèi)化。。接著，作者通過選擇性敲除CD81+細(xì)胞（Cd81-CreERT2Cd36flox / flox小鼠，Cd36CD81 KO小鼠）中的CD36來驗(yàn)證CD36介導(dǎo)米色祖細(xì)胞攝取亞油酸的假說。Cd36CD81 KO小鼠和同窩對照在30℃下用他莫昔芬處理，然后逐漸適應(yīng)8℃3天（圖6D-E）。冷暴露3天后，發(fā)現(xiàn)Cd36CD81 KO小鼠腹股溝WAT中Ki67+ CD81 +細(xì)胞數(shù)量顯著低于對照小鼠45 %（圖6F-G）。組織學(xué)分析顯示，與對照小鼠相比，Cd36CD81 KO小鼠腹股溝WAT中含有更少的多房UCP1 +米色脂肪細(xì)胞（圖6H）。然而，由于Cd36CD81 KO小鼠腹股溝WAT中棕色/米色脂肪選擇性基因的表達(dá)水平低于對照組（圖6I），因此CD36缺失導(dǎo)致的米色脂肪生物合成受損是顯著的。
在沒有任何刺激的情況下，對照組和Cd36CD81 KO來源的CD81+細(xì)胞的增殖沒有差異。然而，亞油酸誘導(dǎo)的Cd36CD81 KO小鼠CD81+細(xì)胞增殖明顯減弱（圖6J）。補(bǔ)充亞油酸后，Cd36CD81 KO小鼠腹股溝WAT中Ki67 + CD81 +細(xì)胞數(shù)量低于對照組小鼠（圖6K）。在Cd36CD81 KO小鼠中，CD81 +細(xì)胞增殖減弱導(dǎo)致米色脂肪生物合成受損，因?yàn)槔浜蛠営退嵫a(bǔ)充對米色脂肪生物合成的加和作用被削弱（圖6L）。此外，與對照組小鼠相比，Cd36CD81KO小鼠腹股溝WAT部位含有較少的多房米色脂肪細(xì)胞（圖6M）。最后得出結(jié)論，病理生理棕色化刺激、冷習(xí)服、b3 - AR激活和燒傷促進(jìn)米色脂肪新生（圖7）。
圖6 CD36是CD81+ APC增殖所必需的
圖7米色脂肪生物生成的模型
參考文獻(xiàn)：
Abe I, Oguri Y, Verkerke ARP, Monteiro LB, Knuth CM, Auger C, Qiu Y, Westcott GP, Cinti S, Shinoda K, Jeschke MG, Kajimura S. (2022). Lipolysis-derived linoleic acid drives beige fat progenitor cell proliferation. Dev Cell;57(23):2623-2637.e8. doi: 10.1016/j.devcel.2022.11.007.