PKM2的乳酸化抑制促炎巨噬細(xì)胞的炎癥代謝適應(yīng)

代謝適應(yīng)是巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志和前提。丙酮酸激酶M2 (PKM2)是促炎巨噬細(xì)胞代謝適應(yīng)的重要決定因素。翻譯后修飾在PKM2的調(diào)控中起核心作用。有研究首次報(bào)道了乳酸通過(guò)激活PKM2抑制Warburg效應(yīng)，促進(jìn)促炎巨噬細(xì)胞向修復(fù)表型的轉(zhuǎn)變，該研究報(bào)告了PKM2的一種新的翻譯后修飾類型，并闡明了其在調(diào)節(jié)促炎巨噬細(xì)胞的炎癥代謝適應(yīng)中的潛在作用。發(fā)表在《INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL SCIENCES》，IF:10.75。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1.PKM2調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的糖酵解

免疫細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)兩種丙酮酸激酶異構(gòu)體PKM1和PKM2，數(shù)據(jù)顯示，na?ve BMDM細(xì)胞中PKM2 mRNA的表達(dá)明顯高于PKM1的表達(dá)(圖1A)。100 ng/ml LPS孵育24小時(shí)后，PKM2的mRNA表達(dá)和蛋白水平顯著增加，也顯著高于25 ng/ml IL-4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞(圖1B, C)。雖然LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的PKM2蛋白水平顯著高于na?ve和IL-4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞，但丙酮酸激酶活性并沒(méi)有顯著差異(圖1D)。BMDM細(xì)胞裂解物的DSS交聯(lián)表明，LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中四聚體形式的PKM2 (240KD)水平顯著低于na?ve和IL-4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞(圖1E)。與PKM2的四聚體形式不同，二聚體/單體形式可以進(jìn)入細(xì)胞核，因此我們?cè)u(píng)估了PKM2的亞細(xì)胞定位。如圖1F所示，LPS導(dǎo)致細(xì)胞核中PKM2的表達(dá)增加。通過(guò)免疫熒光，我們觀察到LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞胞核內(nèi)PKM2的水平明顯高于na?ve和IL -4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞(圖1G)。這些結(jié)果表明PKM2在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，但比在na?ve和IL -4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中更無(wú)活性。結(jié)果表明，PKM2酶抑制劑(Pi;1.2μM Compound 3K)引起LPS孵育的巨噬細(xì)胞中糖酵解速率的顯著增加(圖1H, I)，但未導(dǎo)致OCR的變化(圖1J)?；A(chǔ)OCR: ECAR比值表明，在LPS孵育的巨噬細(xì)胞中，降低PKM2丙酮酸激酶活性誘導(dǎo)代謝轉(zhuǎn)變?yōu)檩^高的糖酵解(圖1K)。這些結(jié)果表明，降低PKM2丙酮酸激酶活性增強(qiáng)了Warburg效應(yīng)，促進(jìn)了LPS孵育的巨噬細(xì)胞的炎癥代謝適應(yīng)。

圖1PKM2調(diào)控脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的糖酵解

2. 乳酸在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中激活PKM2

PKM2調(diào)控糖酵解和乳酸生成;然而，乳酸是否調(diào)節(jié)PKM2仍不清楚。因此，我們首先檢測(cè)了乳酸對(duì)BMDM細(xì)胞中PKM2 mRNA表達(dá)和蛋白水平的影響。結(jié)果表明，外源性乳酸(20mM)的干預(yù)既沒(méi)有改變LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中PKM2的mRNA表達(dá)(圖2A)，也沒(méi)有改變PKM2的蛋白水平(圖2B)。乳酸顯著促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的丙酮酸激酶活性(圖2C)。BMDM細(xì)胞裂解物的DSS交聯(lián)表明，LPS-LA組的PKM2四聚體形式(240KD)水平顯著高于LPS組(圖2D)。免疫熒光結(jié)果顯示，與LPS組相比，LPS-LA組細(xì)胞核中PKM2的表達(dá)明顯降低(圖2E, F)。這些結(jié)果表明，在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中，乳酸激活了PKM2。

圖2乳酸激活脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中的PKM2

3.乳酸抑制糖酵解，并通過(guò)激活PKM2促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向修復(fù)表型的轉(zhuǎn)變

接下來(lái)，我們檢測(cè)了乳酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞ECAR和OCR水平的影響。數(shù)據(jù)顯示，乳酸顯著降低了LPS孵育的巨噬細(xì)胞中的ECAR水平(圖3A, B;LPS+LA組VS LPS組)。此外，我們觀察到乳酸降低了OCR水平(圖3C, D)。總體上，乳酸導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的OCR: ECAR比值顯著上調(diào)(圖3E)。相比之下，PKM2酶抑制劑顯著增加了ECAR水平(圖3A, B;LPS+Pi組vs LPS組)，但沒(méi)有改變OCR水平(圖3C, D)，從而降低了OCR: ECAR比值(圖3E)。PKM2酶抑制劑顯著逆轉(zhuǎn)了乳酸的作用。與LPS+LA組相比，LPS+LA+Pi組ECAR水平較高(圖3A, B)，OCR: ECAR比值較低(圖3E)。這些結(jié)果表明，乳酸可能通過(guò)激活PKM2來(lái)?yè)p害LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的炎癥代謝適應(yīng)。我們分析了乳酸是否通過(guò)激活PKM2促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向修復(fù)表型的轉(zhuǎn)變。在BMDM細(xì)胞中，在LPS (100 ng/ml LPS)孵育48小時(shí)后，乳酸增加了ARG1水平，但降低了iNOS水平(圖3F-H;LPS-LA組vs LPS-48組)。LPS-LA-pi組iNOS水平高于LPS-LA組，ARG1水平低于LPS-LA組(圖3F-H)。這些結(jié)果支持乳酸通過(guò)激活PKM2部分促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向修復(fù)表型轉(zhuǎn)化的理論。

圖3乳酸抑制糖酵解并通過(guò)激活促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向修復(fù)表型的轉(zhuǎn)變PKM2

4.乳酸促進(jìn)傷口巨噬細(xì)胞向修復(fù)表型的轉(zhuǎn)變，并通過(guò)激活PKM2加速小鼠傷口愈合

在本研究中，我們使用小鼠構(gòu)建了皮膚傷口模型，以測(cè)試乳酸是否通過(guò)激活PKM2促進(jìn)傷口巨噬細(xì)胞從促炎表型向修復(fù)表型的轉(zhuǎn)變，并加速傷口愈合。傷后第5天，LA組創(chuàng)面組織中促炎巨噬細(xì)胞(iNOS+ CD68+陽(yáng)性細(xì)胞)數(shù)量明顯低于CTRL組，而修復(fù)性巨噬細(xì)胞(ARG1+ CD68+陽(yáng)性細(xì)胞)水平高于CTRL組 (圖4A、B)。與LA組相比，LA+Pi組中促炎巨噬細(xì)胞數(shù)量較高(圖4A)，而修復(fù)性巨噬細(xì)胞數(shù)量較低(圖4B)。愈合創(chuàng)面照片顯示，LA組小鼠創(chuàng)面愈合速度明顯快于CTRL組(圖4C, D)，而LA+Pi組的創(chuàng)面愈合速度明顯慢于LA組(圖4C, D)。從數(shù)據(jù)可以看出，LA組在第9天的創(chuàng)面面積明顯小于CTRL組(圖4E)，而第9天LA+Pi組的創(chuàng)面面積明顯大于LA組(圖4E)。此外，傷后第5天的再上皮化也驗(yàn)證了創(chuàng)面愈合的速度。LA組移行上皮舌的長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于CTRL組(圖4F)，而LA+Pi組的長(zhǎng)度顯著短于LA組(圖4F)。此外，傷后第12天，三組皮膚質(zhì)量無(wú)顯著差異(圖4G)。這表明乳酸干預(yù)并沒(méi)有降低傷口的愈合質(zhì)量。綜上所述，這些結(jié)果表明，在小鼠中，局部給予外源性乳酸促進(jìn)了傷口巨噬細(xì)胞從促炎表型向修復(fù)表型的轉(zhuǎn)變，并通過(guò)促進(jìn)PKM2丙酮酸激酶活性加速了傷口愈合。

圖4乳酸通過(guò)激活PKM2促進(jìn)小鼠創(chuàng)面巨噬細(xì)胞向修復(fù)表型轉(zhuǎn)化，加速創(chuàng)面愈合

5. 乳酸促進(jìn)PKM2的K62乳酸化

在LPS誘導(dǎo)的BMDM細(xì)胞中，使用PKM2抗體下調(diào)PKM2，并使用抗lactylysine抗體檢測(cè)PKM2的乳化水平。我們觀察到PKM2被乳糖化修飾，20 mM乳酸處理24小時(shí)后，這一修飾顯著增強(qiáng)(圖5A)。IP質(zhì)譜分析表明我們注意到4個(gè)位點(diǎn)(K62、K188、K224和K337)在乳酸干預(yù)后MS峰值強(qiáng)度增加最顯著(圖5B、C)，這表明這些位點(diǎn)對(duì)乳酸孵養(yǎng)更敏感。然后，通過(guò)過(guò)表達(dá)質(zhì)粒在293T細(xì)胞中異位過(guò)表達(dá)標(biāo)記的PKM2，我們構(gòu)建了K62R、K188R、K224R和K337R位點(diǎn)突變或野生型PKM2過(guò)表達(dá)293T細(xì)胞。如圖6D所示，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)PKM2的細(xì)胞中PKM2的水平明顯上調(diào)。接下來(lái)，我們使用標(biāo)志抗體拉低PKM2來(lái)檢測(cè)泌乳水平。結(jié)果證實(shí)，K62R位點(diǎn)突變顯著降低了PKM2的泌乳水平，而其他三個(gè)位點(diǎn)突變對(duì)泌乳水平無(wú)顯著影響(圖5E)。這些結(jié)果表明K62位點(diǎn)是PKM2的主要泌乳位點(diǎn)。PKM2的三級(jí)結(jié)構(gòu)表明，K62位于PKM2蛋白的A結(jié)構(gòu)域(圖5F)，并且與關(guān)鍵活性位點(diǎn)S362相鄰。如圖5G所示，K62在從達(dá)尼奧到各種哺乳動(dòng)物的物種中都是保守的。這些事實(shí)支持K62位點(diǎn)是PKM2功能的潛在調(diào)控位點(diǎn)的假設(shè)。

圖5乳酸促進(jìn)PKM2的K62乳酸化

6.K62R突變體逆轉(zhuǎn)了乳酸對(duì)PKM2丙酮酸激酶活性和巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的調(diào)節(jié)

我們進(jìn)一步評(píng)估了K62位點(diǎn)乳酸化對(duì)PKM2功能的調(diào)節(jié)作用。如圖6A所示，乳酸孵育顯著促進(jìn)了WT型PKM2過(guò)表達(dá)293T細(xì)胞中PKM2酶的活性。K62R突變顯著抑制了乳酸培養(yǎng)后293T細(xì)胞中的PKM2酶活性(圖6B;K62R-LA組vs WT-LA組)。乳酸孵育293T細(xì)胞的裂解產(chǎn)物的DSS交聯(lián)表明，K62R-LA組的PKM2四聚體形式(240KD)水平顯著低于WT-LA組(圖6C)。此外，在乳酸孵育的293T細(xì)胞中，K62R-LA組細(xì)胞核中PKM2的水平約為WT-LA組的1.41倍(圖6D)。這些結(jié)果證實(shí)了K62位點(diǎn)對(duì)PKM2的功能有明顯的影響，并表明乳酸通過(guò)K62位點(diǎn)的泌乳部分促進(jìn)PKM2酶的活性。接下來(lái)，我們使用慢病毒載體在BMDM細(xì)胞中過(guò)表達(dá)K62R突變或野生型PKM2。LPS孵育48小時(shí)后，乳酸增加了WT BMDM細(xì)胞中ARG1的水平，但降低了iNOS的水平(圖6E-G;WT-LPS- la組vs WT-LPS組)。乳酸的這一作用在K62R突變的BMDM細(xì)胞中被顯著削弱(圖6E-G;K62R-LPS- LA組vsK62R-LPS組)。與WT-LPS-LA組相比，K62R-LPS-LA組顯示出較高的INOS水平和較低的ARG1水平(圖6E-G)。這些結(jié)果支持以下結(jié)論:乳酸通過(guò)K62位點(diǎn)PKM2的乳化，部分促進(jìn)了LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向修復(fù)表型的轉(zhuǎn)變。

圖6K62R突變體逆轉(zhuǎn)了乳酸對(duì)PKM2丙酮酸激酶活性和巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的調(diào)節(jié)

結(jié)論：

綜上所述，該研究首次確定了PKM2作為一種乳化底物。乳糖化增加PKM2的丙酮酸激酶活性，減少其四聚體到二聚體的轉(zhuǎn)變和核分布。乳酸通過(guò)激活PKM2導(dǎo)致糖酵解減少，促進(jìn)促炎巨噬細(xì)胞向修復(fù)表型的轉(zhuǎn)變。