SNORD88C促進非小細胞肺癌的生長和轉移

核仁小RNA (snoRNAs)已被證明在癌癥發(fā)展中發(fā)揮關鍵的調節(jié)作用。通過數(shù)據(jù)庫和snoRNA測序篩選到長度為97 nt的SNORD88C。我們首次證實這種snoRNA在組織和血漿中上調，并可作為一種非侵入性診斷生物標志物。在體外和體內實驗中證實SNORD88C促進NSCLC的增殖和轉移。在機制上，SNORD88C促進了28S rRNA上C3680位點的2’- O-甲基化修飾，進而增強了下游SCD1的翻譯，為SNORD88C在NSCLC中的調控提供了新的見解。本文于2022年11月發(fā)表于“Cell Death & Differentiation”（IF=12.067）上。

技術路線

結果

1）SNORD88C在NSCLC中上調，并作為一種非侵入性診斷生物標志物

為了識別NSCLC中異常表達的snoRNA，我們分析了TCGA SNORic數(shù)據(jù)庫中腫瘤組織(包括肺腺癌(LUAD)和肺鱗癌(LUSC))和癌旁組織中snoRNA的表達差異(圖S1A, B)。接下來，對4名健康供體和6名NSCLC患者的血漿進行snoRNA測序，篩選出了12個上調snoRNA和4個下調snoRNA(圖1A)。最后對上述差異snoRNA進行VENN分析(圖1B)，只有SNORD88C重疊，被選為研究對象。我們進一步驗證了SNORD88C在NSCLC中的表達上調。如圖1C所示，無論是TCGA數(shù)據(jù)還是FFPE檢測，腫瘤組織中SNORD88C均明顯升高。TCGA數(shù)據(jù)和FFPE檢測結果均顯示，早期NSCLC (I + II)中SNORD88C表達較正常組織上調（圖1D），提示其在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。進一步驗證178例健康捐贈者和224例NSCLC患者血漿中SNORD88C水平，發(fā)現(xiàn)其在NSCLC和早期NSCLC中上調(圖1E)。SNORD88C主要在無囊泡的血漿中表達，并且在血漿中穩(wěn)定(圖1F)。同時對診斷效果進行ROC曲線分析，NSCLC和早期NSCLC的曲線下面積(AUC)分別為0.7097和0.6406(圖1G)。癌胚抗原(CEA)是臨床上公認的傳統(tǒng)生物標志物，但對早期NSCLC的臨床診斷效率較低。然而，聯(lián)合SNORD88C時，早期NSCLC CEA的AUC從0.6650顯著升高至0.7279(圖1H)。綜上所述，SNORD88C在NSCLC中上調，并作為一種非侵入性診斷生物標志物。

2）在體外和體內，SNORD88C促進NSCLC增殖

為了闡明SNORD88C在NSCLC進展中的作用，我們在三種NSCLC細胞系(A549、H1299和SPC-A1)中過表達或下調SNORD88C。通過CCK-8和集落形成分析來確定SNORD88C對細胞增殖的影響。如圖2A所示，敲低SNORD88C顯著抑制A549和H1299細胞的細胞活力；相反，強制表達SNORD88C可促進SPC-A1和H1299細胞的生長(圖2B)。一致地，沉默SNORD88C的A549和H1299細胞集落形成暫停，而過表達SNORD88C導致SPC-A1和H1299細胞集落形成能力明顯增強(圖2C, D)。為了確定SNORD88C在體內對NSCLC增殖的影響，我們使用SNORD88C穩(wěn)定敲除(LV-sh-SNORD88C)或對照(LV-sh-NC)的A549細胞建立異種移植裸鼠模型。正如預期的那樣，與對照組相比，LV-sh-SNORD88C組的異種移植生長明顯放緩(圖2E)，腫瘤重量和體積明顯減小(圖2F, G)。Caspase-3和Ki67免疫組化染色顯示，LV-sh-SNORD88C促進A549異種移植細胞凋亡，但抑制增殖(圖2H)。綜上所述，在體外和體內NSCLC中，SNORD88C是一種增殖調節(jié)劑。

3）SNORD88C促進NSCLC在體外和體內的遷移和侵襲

我們接下來確定SNORD88C在遷移和侵襲中的作用。傷口愈合實驗顯示，在A549和H1299細胞中，SNORD88C的下調顯著抑制了其遷移能力，而在H1299和SPC-A1細胞中，過表達則促進了其遷移能力(圖3A)。此外，沉默SNORD88C表達后，A549和H1299細胞的遷移和侵襲能力明顯下降，但過表達SNORD88C顯著刺激了這些能力(圖3B)?？紤]到EMT在侵襲和遷移中的重要作用，我們檢測了SNORD88C對EMT相關蛋白表達的影響。如圖3C所示，在A549和H1299細胞中，敲低SNORD88C會增加E-cadherin，抑制N-cadherin, Vimentin和Snail，而在SPC-A1和H1299細胞中，過表達SNORD88C則相反。體內生物發(fā)光成像(BLI)顯示LV-sh-SNORD88C組熒光素酶信號強度顯著低于對照組(圖3D)。與對照組相比，LV-sh-SNORD88C組小鼠肺部發(fā)生的轉移位點更少(圖3E)。此外，H&E染色顯示LV-sh-NC組有部分轉移位點侵犯肺包膜，而LV-sh-SNORD88C組未觀察到(圖3F)。這些結果表明，SNORD88C促進了NSCLC在體外和體內的遷移和侵襲。

4）SNORD88C減弱的自噬是促進其遷移和侵襲所必需的

為了探索SNORD88C的下游靶基因，采用LC-MS/ MS為基礎的TMT標記定量蛋白質組學方法對沉默SNORD88C或陰性對照的H1299進行研究。如圖4A所示，共出現(xiàn)384個上調蛋白和369個下調蛋白，其中大部分富集在代謝相關通路(圖4B)。由于自噬允許細胞在營養(yǎng)應激條件下保持代謝充足并存活，并且可以通過多種代謝途徑進行調節(jié)。因此，我們進一步檢測了SNORD88C對自噬的影響。如圖4C所示，在A549和H1299細胞中，敲低SNORD88C均能激活自噬，而過表達SNORD88C則對SPC-A1和H1299細胞的自噬有抑制作用。相應地，免疫熒光也驗證了SNORD88C敲低后自噬體數(shù)量增加，而SNORD88C過表達后自噬體數(shù)量減少(圖4D)。接下來，透射電子顯微鏡(TEM)進一步證實了這一現(xiàn)象。超微結構上，敲低SNORD88C顯著增加，過表達SNORD88C減少自噬液泡數(shù)量(圖4E)。在SNORD88C沉默或過表達的細胞中，與雷帕霉素處理的細胞一樣，大部分斑點失去了GFP信號，保留了mRFP信號，但與Baf-A1處理的細胞不同，GFP的猝滅明顯減弱(圖4F)，說明SNORD88C對自噬通量影響不大。接下來，我們研究了mTOR/ULK1信號通路是否有助于SNORD88C減弱的自噬。如圖4G所示，敲低SNORD88C導致A549中MTOR及其下游蛋白P70S6K和ULK1的磷酸化下調，而在H1299中過表達SNORD88C后，這些蛋白的磷酸化上調。值得注意的是，AMPK磷酸化不受SNORD88C的影響，這表明SNORD88C調控mTOR/ULK1信號不依賴于AMPK(圖4G)。為了提供SNORD88C減弱的自噬與其誘導的肺癌細胞遷移和侵襲之間的直接聯(lián)系，用ATG5 siRNA (si-ATG5)和質粒(p-ATG5)轉染NSCLC細胞(圖4H)，同時用3-甲基腺嘌呤(3-MA)或雷帕霉素處理，然后進行遷移和侵襲檢測。si-ATG5和3-MA可消除SNORD88C沉默對A549細胞遷移和侵襲的抑制作用，而過表達SNORD88C增強的H1299細胞轉移作用可通過添加p-ATG5或雷帕霉素部分逆轉。總之，這些結果支持SNORD88C抑制自噬，進而促進NSCLC細胞的遷移和侵襲。

5）SNORD88C通過上調SCD1蛋白表達抑制自噬

由于上述LC-MS/MS為基礎TMT標記的定量蛋白質組學富集了不飽和脂肪酸生物合成通路，因此我們對SNORD88C敲除的H1299細胞進行了以脂肪酸為目標的GC-MS代謝組學研究，以確定SNORD88C減弱自噬的代謝產物。如圖5A所示，與對照組相比，SNORD88C敲除的細胞中多種不飽和脂肪酸均有降低，其中單不飽和脂肪酸(MUFA)油酸(OA)的下降更為明顯，說明SNORD88C在脂質積累和過氧化過程中起著至關重要的作用。因此，采用C11-bodipy染色，流式細胞術分析顯示沉默SNORD88C促進脂質過氧化，過表達SNORD88C抑制脂質過氧化(圖5B)。

SCD1是合成MUFA的中心脂肪生成酶，在沉默SNORD88C后，其在上述LC-定量蛋白質組學中也表現(xiàn)出最顯著的變化。重要的是，western blot檢測成功驗證了SNORD88C正調控SCD1蛋白水平，在A549和H1299細胞中，SNORD88C下調后SCD1蛋白水平下降，但在H1299和SPC-A1細胞中，過表達SNORD88C后SCD1蛋白水平顯著升高(圖5C)。流式細胞儀分析顯示，SCD1的過表達和敲低分別能成功逆轉沉默SNORD88C以及過表達SNORD88C對脂質過氧化的促進和抑制作用(圖5D)，提示SNORD88C通過上調SCD1蛋白表達抑制脂質過氧化。此外，我們還探討了SCD1在SNORD88C減弱的自噬中的作用。如圖5E所示，過表達SCD1可以通過下調SNORD88C恢復A549細胞的自噬激活。一致地，SCD1沉默緩解了SNORD88C過表達對自噬的抑制。此外，我們還觀察了SNORD88C和SCD1對mTOR通路的影響。正如預期的那樣，SCD1消除了SNORD88C對mTOR通路相關蛋白的作用，包括pMTOR、pP70S6K、pULK1(圖5F)。最后，我們研究了SNORD88C/SCD1軸與肺癌細胞遷移和侵襲之間的直接聯(lián)系。如圖5G和5H所示，SCD1過表達逆轉了SNORD88C沉默對A549和H1299細胞遷移和侵襲的抑制作用，而SCD1下調則取消了SPC-A1和H1299細胞中SNORD88C過表達對肺癌細胞轉移的促進作用。綜上所述，SCD1是SNORD88C的下游調控蛋白，通過抑制自噬促進NSCLC細胞的遷移和侵襲。

6）SNORD88C通過引導28S rRNA的2’-O-me調控SCD1的翻譯活性

為了探索SNORD88C/ SCD1軸相關的潛在機制，我們首先檢測了SNORD88C對SREBP1的影響，SREBP1是調控SCD1表達的重要轉錄因子。出乎意料的是，SNORD88C對SREBP1的表達沒有明顯的影響(圖6A)，說明SNORD88C沒有調節(jié)SCD1的轉錄，這也被另一個觀察結果證實，即SNORD88C不影響SCD1的mRNA水平(圖6B)。由此，我們推測SNORD88C在轉錄后水平調控SCD1的表達。接下來，使用蛋白酶體抑制劑MG132阻斷蛋白酶體降解。然而，MG132處理明顯增加了SCD1蛋白水平，但未能逆轉SNORD88C對SCD1的調控(圖6C)，這表明涉及一種蛋白降解無關的方式。

先前的研究表明，box C/D snoRNAs在rRNA生物發(fā)生中起著重要作用，因為它們參與核仁中2 '-O-me的引導，進而調節(jié)細胞質中蛋白質的翻譯。首先，我們使用cy3標記的探針靶向SNORD88C進行熒光原位雜交(FISH)檢測細胞分布。如圖6D所示，SNORD88C主要位于細胞核和細胞質中。通過細胞質/核分離的q-PCR進一步驗證了這一結果(圖6E)，表明SNORD88C具有直接調節(jié)rRNA生物學特性的潛力。此外，我們基于生物信息學通過snoPY數(shù)據(jù)庫預測了SNORD88C靶向的rRNA，發(fā)現(xiàn)只有28S rRNA含有與SNORD88C高度互補的序列，更重要的是c3680的2 '-O-me的潛在位點(圖6F)。然后，使用能夠區(qū)分前體(ITS-28S)和總28S rRNA的引物進行量化，然而，無論是在敲除SNORD88C的A549細胞中，還是在過表達SNORD88C的H1299細胞中，成熟28S rRNA均未觀察到明顯變化(圖6G)。接下來，采用RTL-P實驗確認SNORD88C引導的28S rRNA的2’-O-me。在A549細胞中，低濃度dNTPs時，敲低SNORD88C可顯著降低C3680位點28S rRNA的2'-O-me活性，而高濃度dNTPs時則不會(圖6H)。同時，過表達SNORD88C可提高低濃度dNTPs時2'-O-me活性(圖6I)。已有研究表明2'-O-me可提高rRNA誘導的翻譯準確性，進而延長蛋白質半衰期。因此，通過添加環(huán)己亞胺(CHX)來進行體外翻譯試驗。當用CHX處理SNORD88C敲除的A549細胞時，SCD1蛋白的半衰期縮短(圖6J)，而在過表達SNORD88C的H1299細胞中，SCD1蛋白的半衰期延長(圖6K)。最后，為了確定SNORD88C直接影響翻譯的可能性，對其進行了多核糖體分析。如圖6L, M所示，SNORD88C沉默或過表達不影響核糖體部分的分布輪廓，表明SNORD88C不影響全局翻譯。然而，SNORD88C沉默顯著降低了SCD1 mRNA在單體和多體部分的富集，使其分布從較重的核糖體部分向較輕的核糖體部分分布，而SNORD88C過表達則相反，更直接地證明了SNORD88C通過影響翻譯水平調控SCD1的表達。

結論：

我們發(fā)現(xiàn)SNORD88C是NSCLC中一種新的致癌snoRNA。我們證明了SNORD88C在組織和血漿中上調，并可作為一種非侵入性診斷生物標志物；在體外和體內均證實其促進NSCLC的增殖和轉移。重要的是，SNORD88C引導28S rRNA甲基化，顯著提高下游靶基因SCD1的翻譯活性。SCD1作為MUFA合成的限速酶，抑制自噬進一步促進轉移，為SNORD88C在NSCLC中的調控提供了新的視角。

參考文獻：

Wang K, Wang S, Zhang Y, Xie L, Song X, Song X. SNORD88C guided 2'-O-methylation of 28S rRNA regulates SCD1 translation to inhibit autophagy and promote growth and metastasis in non-small cell lung cancer. Cell Death Differ. 2022 Nov 14. doi: 10.1038/s41418-022-01087-9.