一項(xiàng)多組學(xué)研究描述了食管鱗狀細(xì)胞癌的新分子特征和治療靶點(diǎn)

食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)是食管癌的主要組織學(xué)亞型，預(yù)后較差。有研究對(duì)未經(jīng)治療的食管鱗癌和配對(duì)正常癌旁組織進(jìn)行了全面的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)特征分析，以識(shí)別食管鱗癌新的分子弱點(diǎn)和潛在的治療靶點(diǎn)。該研究發(fā)表在《Clinical and Translational Medicine》，IF：8.554。

實(shí)驗(yàn)方法：轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 多層組學(xué)分析ESCC的分子圖譜

我們納入了24例食管鱗癌患者(初治病例)作為隊(duì)列1，并收集了配對(duì)的腫瘤和NAT樣本。我們對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行了RNA-seq、基于數(shù)據(jù)獨(dú)立采集(DIA)的蛋白質(zhì)組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)研究(圖1A)。由于組織樣本的限制，我們只選擇了3對(duì)腫瘤和NAT組織進(jìn)行基于質(zhì)譜的同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析。此外，我們收集了對(duì)照小鼠和由致癌物4-NQO誘導(dǎo)的ESCC小鼠的食管組織，用于RNA-seq和非靶向代謝組學(xué)調(diào)查，以驗(yàn)證ESCC分子特征在不同物種之間的保守性(圖1A)。圖1B總結(jié)了ESCC患者隊(duì)列1的臨床特征。

mRNA的選擇性剪接(AS)允許多種RNA亞型的表達(dá)，并有助于蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性。因此，我們從RNA-seq數(shù)據(jù)中檢測(cè)了包括其各自亞型在內(nèi)的基因表達(dá)。我們利用多層組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了無監(jiān)督層次聚類和主成分分析(PCA)以確定人類食管鱗癌的分子特征。與NAT相比，ESCC組織在基因、基因亞型、蛋白、磷蛋白和代謝物水平顯示出不同的標(biāo)簽(圖1C)。由于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究只在三對(duì)樣本中進(jìn)行，因此磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)被排除在后續(xù)的多變量分析中。接下來，我們使用cluster算法對(duì)RNA-seq、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了整合聚類，結(jié)果清楚地區(qū)分了ESCC和NAT樣本(圖1D)。最后，我們使用DIABLO算法35從所有患者樣本的組學(xué)數(shù)據(jù)中提取分子譜，從而可以計(jì)算任意兩個(gè)分子譜之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示了任意兩個(gè)組學(xué)特征之間的強(qiáng)相關(guān)性(圖1E)，表明ESCC和NAT樣本在不同的分子層之間存在一致的差異。

圖1 ES的多層組學(xué)分析

2. 轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組之間的不一致揭示了活躍的轉(zhuǎn)錄后和翻譯后調(diào)控

下一步是確定ESCC和NAT樣本的mRNA-蛋白關(guān)系差異。首先，我們進(jìn)行了基因相關(guān)分析。盡管在兩組樣本中，mRNA和蛋白的表達(dá)水平存在顯著差異，食管鱗癌組織的中位相關(guān)值為0.06，而NAT的中位相關(guān)值為0，但腫瘤組織的相關(guān)值相對(duì)于NAT的分布出現(xiàn)右移 (圖2A)，表明在腫瘤組織中有較強(qiáng)的正相關(guān)性。食管鱗癌和NAT組織的中位相關(guān)值分別為0.20和0.15。與NAT相比，食管鱗癌組織顯示出明顯的相關(guān)值分布右移 (圖2B)，表明在腫瘤組織中有較強(qiáng)的正相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中大部分蛋白不僅在相應(yīng)mRNA增加時(shí)上調(diào)，而且在相應(yīng)mRNA不受干擾或減少時(shí)也上調(diào)(圖2C)。然而，無論相應(yīng)mRNA的表達(dá)模式如何，NAT組織中的大多數(shù)蛋白均下調(diào)(圖2C)。此外，與NAT相比，在ESCC腫瘤中觀察到更多上調(diào)的mRNA (圖2C)。總之，這些結(jié)果表明，mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯在食管鱗癌組織中增強(qiáng)，并且轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)過度活躍。

因此，假設(shè)在食管鱗癌腫瘤中，那些在mRNA和蛋白水平上表達(dá)增加的基因(即具有高轉(zhuǎn)錄和翻譯活性)作為核心上游信號(hào)，導(dǎo)致了在食管鱗癌和NAT組織中觀察到的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的差異。為了驗(yàn)證假設(shè)，我們納入了在腫瘤組織中mRNA豐度增加，并且在所有組織中mRNA和相應(yīng)蛋白呈正相關(guān)的基因進(jìn)行分析。GO分析顯示，RNA加工、RNA切片和基因表達(dá)的活性在食管鱗癌腫瘤中顯著增強(qiáng)(圖2D)。在這480個(gè)基因中，在ESCC組織中產(chǎn)生極高水平蛋白的基因包括SRSF10、SF3A2、CSTF2和RIF1(圖2E)。在我們的ESCC腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)中，SRSF10、SF3A2和CSTF2與增殖標(biāo)志物Ki-67和/或PCNA呈正相關(guān)(圖2F)。此外，SRSF10和SF3A2與分化標(biāo)志物S100A14呈負(fù)相關(guān)(圖2F)。SRSF10、SF3A2和CSTF2可能參與了食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展。

圖2轉(zhuǎn)錄組和蛋白之間的相關(guān)性

然后，我們假設(shè)上述的蛋白質(zhì)活性參與上游信號(hào)傳導(dǎo)，并通過改變蛋白質(zhì)組影響轉(zhuǎn)錄后控制。因此，我們使用參與轉(zhuǎn)錄后和翻譯后水平控制的所有蛋白質(zhì)和選擇的基因集進(jìn)行了GSEA。正如預(yù)期的那樣，在轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)功能方面，腫瘤的富集程度顯著高于NAT(圖3A)。然后，我們提取了轉(zhuǎn)錄后和翻譯后調(diào)節(jié)的關(guān)鍵蛋白，包括RNA轉(zhuǎn)錄成員、調(diào)節(jié)大量細(xì)胞RNA豐度的無義介導(dǎo)的mRNA衰變(NMD)途徑、蛋白質(zhì)翻譯的關(guān)鍵真核起始因子(EIF)復(fù)合體和蛋白質(zhì)降解的關(guān)鍵蛋白泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)。其中，大多數(shù)在食管鱗癌和NAT組織中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)在腫瘤中表達(dá)上調(diào)(圖3B-E)，這與食管鱗癌組織中RNA轉(zhuǎn)錄、RNA衰變、蛋白質(zhì)翻譯和蛋白質(zhì)水解的速度加快一致。

已知AS是一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄后過程，為了提供更多關(guān)于ESCC中活躍的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的證據(jù)，我們使用SpliceSeq工具分析了我們RNA-seq數(shù)據(jù)中7種常見的AS事件，包括替代受體位點(diǎn)(AA)、替代供體位點(diǎn)(AD)、替代啟動(dòng)子(AP)、替代終止子(AT)、外顯子跳躍(ES)、互斥外顯子(ME)和保留內(nèi)含子(RI)。我們計(jì)算了RNA轉(zhuǎn)錄本的剪接百分比(PSI)值，該值揭示了這些序列在特定AS事件中剪接成轉(zhuǎn)錄本的效率39ESCC腫瘤和NAT之間有3883個(gè)PSI值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的RNA轉(zhuǎn)錄本，在腫瘤中觀察到更多的AA、AD、AT、ES和RI事件(圖3F)。這與之前的研究一致，即與NAT組織相比，乳腺癌和結(jié)直腸癌組織中的AS事件增加。

圖3轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯和翻譯后的機(jī)制研究

3. 分子途徑和代謝特征的綜合說明

由于mRNA和蛋白質(zhì)之間的高度不一致性，我們使用蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)來描繪人食管鱗癌的多層分子改變。首先，我們利用蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析了食管鱗癌中失調(diào)的通路。食管鱗癌組織中有2890個(gè)DEPs (圖S10A)。然后，我們構(gòu)建了proteomaps，根據(jù)KEGG通路注釋將DEPs聚類，并觀察到ESCC腫瘤和NAT之間存在顯著差異(圖4A)。食管鱗癌腫瘤組織中剪接體、組蛋白和核糖體相關(guān)蛋白水平較高，細(xì)胞骨架蛋白水平較低。隨后，我們使用這些DEPs進(jìn)行了GSVA18，以量化通路激活。共有157條通路在ESCC腫瘤中被發(fā)現(xiàn)顯著干擾 (圖4B)。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)顯示，這些磷酸鹽的相應(yīng)蛋白參與RNA轉(zhuǎn)錄、加工和代謝的通路在人食管鱗癌腫瘤中被激活 (圖4C)。

隨后，我們利用代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析了人類食管鱗癌的代謝特征。有56.50%(113/200)的代謝物在食管鱗癌組織中存在差異表達(dá)。在這些差異表達(dá)代謝物DEMs中，83.19%(94/113)表達(dá)上調(diào)(圖4D)，表明ESCC腫瘤具有活躍的代謝特征。然后，我們使用這113個(gè)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行MSEA，并在食管鱗癌腫瘤中觀察到總共17條代謝通路有顯著擾動(dòng) (圖4E)。其中58.82%(10/17)的通路與氨基酸代謝有關(guān)，表明氨基酸代謝紊亂在食管鱗癌中占主導(dǎo)地位。

圖4 ESCC分子特征的多組學(xué)分析

蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)表明，與RNA轉(zhuǎn)錄、加工和代謝相關(guān)的通路活性增加，表明這些通路對(duì)食管鱗癌的病理生物學(xué)至關(guān)重要。下一節(jié)將詳細(xì)分析這些途徑。然后，我們利用代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，對(duì)食管鱗癌中最受干擾的代謝通路精氨酸和脯氨酸代謝進(jìn)行了綜合分析。該網(wǎng)絡(luò)強(qiáng)調(diào)指出，ESCC腫瘤選擇性地表達(dá)了幾種代謝酶，從而加快了氨基酸的生成(圖5A)。鑒于代謝物在細(xì)胞表型確定中的重要性，我們對(duì)代表ESCC關(guān)鍵細(xì)胞表型的DEMs和DEPs進(jìn)行了相關(guān)性分析(圖5B)。這些代謝物包括5個(gè)氨基酸(半胱氨酸、谷氨酰胺、氨基丙二酸、甲基半胱氨酸和3-亞砜-丙氨酸)、2個(gè)碳水化合物(山梨醇和阿拉伯糖醇)、1個(gè)核苷酸(胞苷)、2個(gè)有機(jī)酸(蘋果酸和脫氫抗壞血酸)、1個(gè)維生素(吡哆醇)和2個(gè)未分類的代謝物(組胺和2-羥基吡啶)。這些結(jié)果表明，改變的代謝物可能參與影響食管鱗癌的干性。

圖5利用蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)綜合分析ESCC的分子特征

4. 通過蛋白質(zhì)組學(xué)和磷蛋白質(zhì)組學(xué)分析，RNA轉(zhuǎn)錄、加工和代謝的刺激途徑被揭示

如上所述，蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)確定了參與RNA轉(zhuǎn)錄、加工和代謝的通路(圖4B,C)，因此提示了這些通路在ESCC惡性程度中的重要性。因此，這些通路的特征被徹底解剖。各通路中顯著上調(diào)的蛋白占全部富集蛋白和差異蛋白的百分比分別為:剪接體(KEGG) 97.75%、含內(nèi)含子的pre-mRNA的加工100.00%、mRNA轉(zhuǎn)錄形成和成熟100.00%、mRNA剪接100.00%、來自含內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄本的成熟mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)100.00%、延伸和處理封頂轉(zhuǎn)錄物100.00%和轉(zhuǎn)錄100.00% (圖6)。而食管鱗癌腫瘤中顯著增強(qiáng)的磷酸化位點(diǎn)占各通路中完全富集和差異磷酸化位點(diǎn)的百分比值分別為87.50%、96.15%、100.00%、95.83%、95.00%(19/20)、93.75%、100.00% (圖6)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明這些分子通路在食管鱗癌腫瘤中受到異常刺激。

圖6 通過蛋白質(zhì)組學(xué)和磷蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的綜合分析，確定了ESCC的基本途徑

5. 具有預(yù)后潛力的蛋白質(zhì)標(biāo)記物的鑒定

對(duì)于患者隊(duì)列1的食管鱗癌組織中的DEPs，我們?cè)噲D鑒定那些與患者生存密切相關(guān)并可能參與食管鱗癌進(jìn)展的蛋白質(zhì)。采用單因素Cox模型分析各蛋白與患者生存期的關(guān)系，共鑒定出118個(gè)具有預(yù)后潛力的蛋白。在這些蛋白質(zhì)中，66個(gè)與疾病復(fù)發(fā)或死亡風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)(圖7A)。KEGG通路分析顯示，這118個(gè)預(yù)后蛋白主要富集在吞噬體、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路、p53信號(hào)通路、果糖和甘露糖代謝通路 (圖7B)。

分析66個(gè)與HR正相關(guān)的預(yù)后蛋白在食管鱗癌患者組織中蛋白及相應(yīng)mRNA水平的變化。其中23個(gè)蛋白與其對(duì)應(yīng)的mRNA表現(xiàn)出一致的表達(dá)方向，表明這些蛋白在轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)節(jié)(圖7C)。其中14個(gè)基因包括HACD2、RBM3、MRPL14、PCNP、XPNPEP3、TBC1D5、BPTF、CEP170B、PTPN13、NAA50)、SNRPF、NUP43、FBL和CHCHD2的蛋白和mRNA水平均顯著上調(diào)(圖7C)。在4-NQO誘導(dǎo)的ESCC小鼠中檢測(cè)這些基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照小鼠相比，其中RBM3、BPTF和FBL在ESCC小鼠的食管組織中顯著增加(圖7D)，表明這三個(gè)基因在ESCC中的上調(diào)在不同物種中是保守的。接下來，我們選擇了5個(gè)在ESCC腫瘤中上調(diào)最多的蛋白質(zhì)，包括HACD2, RBM3, MRPL14, PCNP和XPNPEP3，以及BPTF和FBL進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖7 有預(yù)后價(jià)值的蛋白質(zhì)標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)

6. 驗(yàn)證和功能分析強(qiáng)調(diào)FBL是一個(gè)新的不利預(yù)后的生物標(biāo)志物

隨后，我們納入了食管鱗癌患者隊(duì)列2 (n = 41)，并進(jìn)行了Western blot檢測(cè)，以驗(yàn)證上述7種具有預(yù)后潛力的蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，FBL, XPNPEP3和BPTF在ESCC腫瘤中相對(duì)于配對(duì)NAT顯著增加(圖8A)。然后我們探討了FBL、BPTF和XPNPEP3對(duì)ESCC細(xì)胞惡性腫瘤的影響。利用兩種人ESCC細(xì)胞系KYSE150和Eca109分別刪除FBL、BPTF和XPNPEP3，通過對(duì)每個(gè)基因使用兩個(gè)不同的引導(dǎo)RNA。體外研究顯示，FBL的去除顯著下調(diào)了細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA的表達(dá)，并顯著抑制了ESCC細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖8B)。體內(nèi)研究顯示，FBL缺失顯著損害KYSE150異種移植瘤的腫瘤生長(zhǎng)(圖8C,D)。最后，我們納入了一個(gè)ESCC患者隊(duì)列3 (n = 100)，對(duì)FBL進(jìn)行了免疫組化染色研究，結(jié)果證實(shí)了FBL在ESCC腫瘤中的表達(dá)相對(duì)于NAT上調(diào)，以及其作為預(yù)后生物標(biāo)志物的有用性(圖8E)。重要的是，FBL高表達(dá)預(yù)示著ESCC患者較差的總生存期和無復(fù)發(fā)生存期(圖8F)。

圖8預(yù)后蛋白標(biāo)記物的驗(yàn)證和功能分析

7. 參與ESCC發(fā)育的關(guān)鍵分子事件綜述

如上所述，FBL在體外和體內(nèi)對(duì)ESCC細(xì)胞的生長(zhǎng)至關(guān)重要。FBL是一種核仁甲基轉(zhuǎn)移酶，主要作用于rRNA和組蛋白H2A的位點(diǎn)特異性甲基化，從而促進(jìn)核糖體組裝和早期胚胎發(fā)育。因此，它在腫瘤中增加的存在表明，表觀遺傳調(diào)節(jié)和核糖體中的mRNA翻譯可能參與了ESCC的發(fā)展。其次，作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄后過程，AS在ESCC腫瘤中是活躍的(圖3F)。此外，在ESCC腫瘤中刺激了與RNA轉(zhuǎn)錄、加工和代謝相關(guān)的通路(圖6)?？傊?，這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄后和翻譯后調(diào)控參與了食管鱗癌的發(fā)展。最后，一系列代謝物和代謝通路在食管鱗癌腫瘤中上調(diào)(圖4D,E)，這意味著激活的代謝是維持食管鱗癌惡性所必需的。綜上所述，我們推斷表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄后、翻譯后和代謝層的分子事件密切合作，促進(jìn)了ESCC的發(fā)生和進(jìn)展(圖9)。

圖9 通過多層研究描述ESCC發(fā)育過程中的分子事件的模型

8. 腫瘤抗原和潛在癌癥驅(qū)動(dòng)因素和關(guān)鍵激酶的藥物注釋

包括CT抗原在內(nèi)的新腫瘤抗原的鑒定將為癌癥免疫治療疫苗的開發(fā)提供更多的機(jī)會(huì)通過蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)四種已知的CT抗原MAGEB2、MAGEA4、MAGEA8和SPAG9在ESCC腫瘤中明顯升高，與NATs相比，FC范圍為1.84至223.50 (圖10A)。此外，識(shí)別改變的潛在癌癥驅(qū)動(dòng)因子和激酶將提高我們對(duì)癌癥生物學(xué)的理解，并產(chǎn)生新的治療靶點(diǎn)。我們使用我們的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了研究。通過將我們的數(shù)據(jù)與之前描述的潛在癌癥驅(qū)動(dòng)因素列表進(jìn)行比較21，我們確定了32個(gè)在ESCC組織中增加4倍以上的潛在驅(qū)動(dòng)因素 (圖10B)。此外，通過與PhosphoSitePlus和NetworKIN的激酶列表進(jìn)行數(shù)據(jù)比較，我們發(fā)現(xiàn)29種已知激酶在ESCC組織中增加了4倍以上 (圖10C)隨后，我們利用兩個(gè)藥物數(shù)據(jù)庫(kù)DrugBank和PKIDB 對(duì)這些在食管鱗癌中升高的潛在癌癥驅(qū)動(dòng)因子和激酶進(jìn)行了藥物注釋。結(jié)果顯示，21.88%(7/32)的癌癥驅(qū)動(dòng)因子和86.21%(25/29)的激酶具有靶向抑制劑(圖10B,C)。這些抑制劑可作為食管鱗癌的新療法。

圖10 ESCC中腫瘤抗原的鑒定及潛在腫瘤驅(qū)動(dòng)因子和關(guān)鍵激酶的藥物注釋

結(jié)論

通過使用多組學(xué)方法，我們破譯了與食管鱗癌發(fā)生和發(fā)展有關(guān)的新分子事件，包括甲基轉(zhuǎn)移酶的異常表達(dá)，轉(zhuǎn)錄后和翻譯后過度活躍的調(diào)節(jié)，以及重塑的代謝。這些發(fā)現(xiàn)加深了我們對(duì)食管鱗癌病理生物學(xué)的理解，并為食管鱗癌患者的危險(xiǎn)分層提供了新的預(yù)后生物標(biāo)志物。這些發(fā)現(xiàn)為食管鱗癌的治療提供了新的靶點(diǎn)和策略。