蛋白質(zhì)組學(xué)比較分析鑒定了胰腺癌相關(guān)星狀細(xì)胞小細(xì)胞外囊泡中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)

人胰腺星狀細(xì)胞（HPSC）是胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）進(jìn)展的重要基質(zhì)成分和介質(zhì)。小細(xì)胞外囊泡（sEV）是參與細(xì)胞間通訊的膜封閉納米顆粒，并從PDAC內(nèi)的基質(zhì)細(xì)胞釋放。來自正常胰腺星狀細(xì)胞（HPaStec）和PDAC相關(guān)星狀細(xì)胞（HPSC）的sEV的詳細(xì)比較仍然是研究者目前關(guān)于星狀細(xì)胞和PDAC的知識中的一個空白。探索PDAC腫瘤周圍活化HPSC的機(jī)制作用對于提高研究者對涉及基質(zhì)和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞間通訊的理解至關(guān)重要。該研究發(fā)表于《Molecular & Cellular Proteomics》，IF：7.381。

研究路線：

圖形摘要：

主要研究結(jié)果：

1. 星狀細(xì)胞分泌的sEV的分離和物理表征

HPSCs類似于肝星狀細(xì)胞，是肝纖維化中的重要效應(yīng)細(xì)胞，對vimentin，desmin和α-SMA染色呈陽性。使用差分UC步驟從HPSC和HPaStec-CM中分離sEV并稍作修改（圖1A）。然后對sEV的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行定量。為了分析形狀和尺寸分布，用戊二醛固定10 μgsEV，并用乙酸鈾酰染色并使用TEM成像。HPSC和HPaStec sEV的透明，圓形或橢圓形顆粒的代表性電子顯微照可見，并使用TEM捕獲，如圖1B所示。盡管這兩個類別中的大多數(shù)sEV的尺寸范圍都在50 nm至200 nm之間，但與HPaStec sEV相比，大多數(shù)較小尺寸的HPSC sEV在電子顯微照片中被捕獲（圖1B）。

接下來，為了確認(rèn)大小分布并確定兩種細(xì)胞類型釋放的sEV濃度，研究者使用NanoSight NS300對適當(dāng)稀釋的sEV樣品進(jìn)行了NTA。HPSC（六種獨(dú)立制劑）和HPaStec sEV（五種獨(dú)立制劑）的平均粒徑分別為182.2至220.9 nm和154.4至191 nm（圖1C）。

圖1sEV的隔離和物理表征

為了進(jìn)一步表征這些sEV的差異，研究者進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析以檢測sEV中已建立的外泌體表面標(biāo)志蛋白（Alix，CD63，TSG101，EGFR和CSE1L）和任何細(xì)胞骨架（肌動蛋白）或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Calnexin）污染的表達(dá)。這些表面標(biāo)志物存在于sEV中，并且提取物沒有細(xì)胞骨架/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)污染（圖2A）。研究者使用與Java 1.8.0_172軟件捆綁在一起的ImageJ對蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行了定量分析（圖2B）。與HPaStec sEV相比，HPSC sEV中大多數(shù)外泌體標(biāo)志物的富集度顯著更高（圖2B）。接下來，在HPaStec（圖2C）和HPSC-sEV（圖2D）結(jié)合的磁珠中進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，以分析CD63的表達(dá)，CD63是四跨蛋白外泌體標(biāo)志物之一。圖2C和2D中具有適當(dāng)同種型控制的代表性直方圖和圖2E中的平均條形圖顯示，HPSC中CD63的中位熒光強(qiáng)度明顯比HPaStec sEV高2倍。

圖2星狀細(xì)胞分泌的sEV和外泌體標(biāo)志物的表征和定量

2. sEV與正常HPaStec細(xì)胞共培養(yǎng)調(diào)節(jié)α-SMA表達(dá)

為了探索在HPSC和HPaStec sEV存在下正常星狀細(xì)胞的活化，將兩種sEV與正常HPaStecs以20μg/ml的濃度共培養(yǎng)72小時，然后進(jìn)行α-SMA染色。有趣的是，根據(jù)研究者的數(shù)據(jù)，通過sEVs處理，兩種類型的EV相對于通過免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡檢測到的未處理對照顯著降低了α-SMA表達(dá)（圖3A-C）。

圖3sEVs對正常星狀細(xì)胞的影響以及正常上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞對PKH-26標(biāo)記的sEV的攝取

3. 正常上皮細(xì)胞和PDAC細(xì)胞系對sEV的攝取

接下來，為了研究正常和癌細(xì)胞系對HPSC和HPaStec sEV的攝取，研究者用紅色熒光染料（PKH-26）標(biāo)記sEV，該染料具有長脂肪族尾巴，并入脂質(zhì)膜。接下來，將20μg/ml的PKH-26標(biāo)記的sEV與正常上皮細(xì)胞，HPNE和PDAC細(xì)胞系Miapaca2和Panc1孵育24小時。用甲醇固定細(xì)胞并證明sEV的定位，用代表單個細(xì)胞的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的β-微管蛋白染色細(xì)胞，DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。使用共聚焦顯微鏡的免疫熒光成像確定了PKH-26標(biāo)記的HPSC sEV在正常和胰腺癌細(xì)胞中的總體攝?。▓D3D和E）以及panc1和Miapaca2細(xì)胞中HPaStec sEV的攝取（圖3H）。圖像的更高放大倍率（1890X）顯示大多數(shù)sEV積聚在細(xì)胞的細(xì)胞膜上（圖3E和H）。細(xì)胞系之間的HPSC sEV攝取沒有顯著差異（圖3F和G）。Panc1細(xì)胞對HPaStec sEV的攝取明顯高于Miapaca2細(xì)胞（圖3I）。

4. sEV上的膜蛋白對于正常細(xì)胞系和癌細(xì)胞系中更好地攝取sEV可能至關(guān)重要

為了確定富含膜蛋白的HPSC衍生的sEV對于正?；虬┘?xì)胞更好地攝取sEV是否至關(guān)重要，未消化的PKH-27標(biāo)記的HPSC sEV（20μg/ml）或100ng蛋白酶K消化的PKH-26標(biāo)記的HPSC sEV被HPNE，Panc1和Miapaca2細(xì)胞處理6小時?；罴?xì)胞對sEV的攝取通過EVOS FL自動顯微鏡的實(shí)時成像可視化（圖3J）。與正常（HPNE）和癌細(xì)胞（Panc1和Miapaca2）對未消化的sEV的更高水平攝取相比，用蛋白酶K消化外泌體表面蛋白顯著減少了sEVs進(jìn)入HPNE，PANC1和Miapaca2細(xì)胞（圖3J）。

5. 蛋白質(zhì)組學(xué)確定了正常和癌癥相關(guān)人胰腺星狀細(xì)胞sEV之間的差異

PDAC相關(guān)的HPSC細(xì)胞比HPaStec分泌更多的外泌體sEV，并且含有完整膜蛋白的sEV更容易被癌細(xì)胞吸收。因此，為了測試HPSC和HPaStec細(xì)胞的sEV中的膜蛋白表達(dá)水平是否不同，將兩種細(xì)胞以生物一式三份生長。使用LC-MS/MS蛋白質(zhì)組學(xué)收獲和分析sEV。使用MaxQuant處理后進(jìn)行定量和質(zhì)量控制，研究者鑒定了1481個蛋白質(zhì)組進(jìn)行進(jìn)一步分析。與外泌體富集一致，ExoCarta數(shù)據(jù)庫中列出了1239個蛋白質(zhì)組和1088個ExoCarta蛋白在兩種細(xì)胞類型的外泌體中鑒定（圖4A）。分別在HPSC或HPaStec sEV中獨(dú)家鑒定了60或91種ExoCarta蛋白（圖4A）。

圖4HPSC和HPastec sEVs的差異蛋白表達(dá)水平的維恩圖和火山圖

研究者進(jìn)行了Welch的t檢驗(yàn)，并使用Benjamini-Hochberg方法調(diào)整了p值來測試HPSC和HPaStec sEV之間的蛋白質(zhì)含量差異。研究者確定了87個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)組（圖4B和圖4C）。在HPSC sEV中升高的前10種蛋白質(zhì)中，CSE1L顯著更高。

接下來，研究者使用Enrichr R包對87個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了途徑富集分析?；诨虮倔w：生物過程（GO：BP）的頂級顯著富集途徑與外泌體富集一致，包括細(xì)胞外基質(zhì)組織、多泡體組裝和細(xì)胞-基質(zhì)粘附。使用基因本體的頂級顯著富集途徑：細(xì)胞成分還包括細(xì)胞外或細(xì)胞膜途徑，如局灶粘附，絲狀肢和吞噬細(xì)胞囊泡。GO：BP通路分析顯示，HPSC sEVs中轉(zhuǎn)運(yùn)（ESCRT）復(fù)合物拆卸和多泡體組織和組裝所需的內(nèi)體分選復(fù)合物，而HPaStec sEVs具有升高的細(xì)胞粘附和細(xì)胞外組織途徑。ESCRT途徑含有泛素化和促進(jìn)多泡內(nèi)體內(nèi)sEV內(nèi)化的膜蛋白。HPSC sEVs的GO：BP分析確定了與溶酶體相關(guān)的大量差異表達(dá)蛋白，溶酶體是細(xì)胞中蛋白質(zhì)更新的主要部分。

通路富集的一個已知缺點(diǎn)是它不考慮通路成員之間的相互作用。因此，研究者假設(shè)基于交互的方法將捕獲超越途徑富集發(fā)現(xiàn)的其他關(guān)系。為了驗(yàn)證這一前提，研究者使用STRING蛋白-蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫查詢了87個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)組。如果存在多個蛋白質(zhì)，研究者使用蛋白質(zhì)組中的第一個蛋白質(zhì)，并且研究者至少需要中等置信度的相互作用。所得網(wǎng)絡(luò)的相互作用明顯多于預(yù)期，由此，研究者發(fā)現(xiàn)69個蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)在一個大型子網(wǎng)中共享邊緣（圖5），ITGB1 具有最高的連接度數(shù)或連接數(shù)。這些結(jié)果表明差異表達(dá)的蛋白質(zhì)組之間存在共性，并可能指向驅(qū)動HPSC-HPaStec差異的更深層次的生物學(xué)過程。

圖5 STRING蛋白-蛋白相互作用

6. CSE1L在PDAC相關(guān)的胰腺星狀細(xì)胞sEV中表達(dá)，與生存率低有關(guān)

研究者已經(jīng)確定了在HPSC sEV中高度升高的特定蛋白質(zhì)標(biāo)記物，其中CSE1L是CSE1的人類同系物，是一種酵母染色體分離蛋白，優(yōu)先在HPSC sEV中積累。CSE1L在HPSC sEV中顯著增加。CSE1L/XPO2_HUMAN由肽AADEEAFEDNSEEYIRR鑒定，質(zhì)量數(shù)測量精度為4.36 ppm。為了驗(yàn)證，使用完整肽同位素的提取離子色譜圖進(jìn)行相對定量以及每個樣品中所有已鑒定的CSE1L蛋白肽的歸一化信號強(qiáng)度之和顯示，與HPaStec sEV相比，HPSC sEV的強(qiáng)度增加（圖6A-C）。HPSC sEV組分中的CSE1L表達(dá)也顯著高于HPaStec sEVs（圖2A）通過蛋白質(zhì)印跡分析。鑒于HPSC中CSE1L的急劇增加，研究者假設(shè)其發(fā)現(xiàn)可能與PDAC患者的結(jié)局有關(guān)。因此，研究者通過CSE1L基因表達(dá)測量和臨床結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)從癌癥基因組圖譜（TCGA）中確定了174例PDAC患者，并通過中位CSE1L表達(dá)對這些患者進(jìn)行分層。Kaplan-Meier生存分析顯示，較高的CSE1L表達(dá)與生存率顯著降低有關(guān)。

7. HPSC sEVs處理后Panc1細(xì)胞中的CSE1L表達(dá)和ERK信號傳導(dǎo)

接下來，為了研究HPSC sEVs和HPaStec sEVs對CSE1L表達(dá)的影響，在使用CSE1L，CD63和β-肌動蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析之前，將HPSC sEVs（20μg/ ml）與Panc1或Miapaca2細(xì)胞共培養(yǎng)72小時。此外，為了確定sEVs對細(xì)胞的處理是否誘導(dǎo)細(xì)胞存活信號傳導(dǎo)，研究者評估了sEVs處理后的磷酸化ERK信號傳導(dǎo)。蛋白質(zhì)印跡顯示，在使用HPSC sEV處理后，Panc1細(xì)胞中的CSE1L表達(dá)升高和ERK信號傳導(dǎo)增加（圖6D），但在Miapaca2細(xì)胞中沒有。相反，原代HPaStec sEV不調(diào)節(jié)任何癌細(xì)胞中CSE1L或ERK信號傳導(dǎo)的表達(dá)（圖6D）。

圖6CSE1/XPO2的LC-MS/MS鑒定

結(jié)論：

該研究成功鑒定了從PDAC相關(guān)星狀細(xì)胞分離的HPSC sEV和從正常胰腺分離的sEV中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。該研究結(jié)果表明，HPSC sEVs在生物學(xué)上與HPaStec sEVs不同，可能為胰腺癌細(xì)胞提供有利的微環(huán)境，并可能成為將藥物或其他生物材料安全輸送到癌細(xì)胞的貨運(yùn)載體。需要進(jìn)一步的研究來闡明癌癥相關(guān)的星狀細(xì)胞sEVs在PDAC進(jìn)展中的作用，這將為針對腫瘤基質(zhì)的治療干預(yù)開辟道路。

參考文獻(xiàn)：

Sarcar B, Fang B, Izumi V, O Nunez Lopez Y, Tassielli A, Pratley R, et al. A comparative Proteomics Analysis Identified Differentially Expressed Proteins in Pancreatic Cancer-Associated Stellate Cell Small Extracellular Vesicles. Mol Cell Proteomics. 2022 Dec;21(12):100438. doi: 10.1016/j.mcpro.2022.100438.