C/D box小核仁RNA SNORD104通過調節(jié)PARP1的2'O-甲基化促進子宮內膜癌

子宮內膜癌（EC）是發(fā)達國家絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球范圍內呈上升趨勢。盡管手術、化療和放療取得了令人滿意的結局，但由于腫瘤細胞有復發(fā)和轉移的趨勢，EC患者的生存率仍然很低。因此，闡明EC起始、進展和轉移的分子機制對于確定個性化治療的潛在治療靶點至關重要。小核仁RNA（snoRNA）是一類具有保守結構元件的小非編碼RNA（ncRNA），廣泛分布在真核細胞的核仁中，大致分為C/D box snoRNA（SNORD）和H/ACA box snoRNA。它們通常由編碼基因或非編碼基因的內含子區(qū)域編碼，并且由于宿主基因的轉錄和加工而變得復雜，只有少數(shù)由獨立的基因組位置編碼。最近的研究表明，snoRNA通過互補堿基配對介導rRNA、tRNA、mRNA、snRNA和其他RNA的2'-O-甲基化和假尿苷化，并通過與核糖核仁蛋白（RNP）形成snoRNP復合物來調節(jié)基因表達。該研究發(fā)表于《Journal of Translational Medicine》，IF：8.44。

研究路線：

主要研究結果：

1. SNORD104在EC組織中上調

作者分析了來自TCGA數(shù)據(jù)集的548個EC組織樣本和35個正常子宮內膜組織樣本的轉錄組譜（圖1A），并發(fā)現(xiàn) SNORD104 在 EC 樣品中上調。為了驗證這些結果，作者分析了廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院收集的術后EC組織中SNORD104的表達，并分析了SNORD104表達與臨床病理特征之間的相關性。與I/II期疾病患者（n = 46）相比，III/IV期疾病患者（n = 13）的SNORD104表達更高（圖1B）。此外，SNORD104在低分化（n = 15）與中分化或高分化（n = 44）腫瘤中上調（圖1C）。與淺肌層浸潤患者（n = 33）相比，深部肌層浸潤（n = 26）患者的SNORD104表達更高（圖1D），以及淋巴結轉移患者（n = 26）相對于沒有淋巴結轉移的患者（n = 33）的SNORD104表達也更高（圖1E）。相比之下，SNORD104表達與血管浸潤之間沒有顯著相關性（圖1F）。因此，作者假設SNORD104在EC中作為癌基因起作用。

圖1SNORD104在EC組織中上調，并與臨床病理特征相關

2. 敲低SNORD104在體外抑制EC細胞的惡性電位

基因組序列分析表明，SNORD104是從SNHG25基因（小核仁RNA宿主基因25，位于17q21.3）的初級轉錄本的第一內含子區(qū)域加工而來的（圖1G），成熟的SNHG25 RNA是從外顯子轉錄而來的。作者發(fā)現(xiàn)SNHG25在EC組織中也上調。此外，與永生化子宮內膜細胞相比，SNORD104在EC細胞系中上調。SNORD104和SNHG25在石川細胞中均高表達，但在HEC1B和HEC1A細胞中表達水平相對較低（圖2A）。先前的研究表明，snoRNA的宿主基因調節(jié)其各自的snoRNA并在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮作用。為了確定SNORD104和SNHG25在EC細胞中的作用，作者分別用SNHG25特異性小干擾RNA（siRNA）轉染石川細胞，用SNHG25過表達質粒轉染HEC1B細胞，并在HEC1B細胞中轉染靶向SNORD104的反義寡核苷酸序列（ASO）。通過qRT-PCR驗證了敲低效率（圖2B）。SNORD104敲低顯著降低了石川細胞的生存能力、增殖（圖2C，D）、克隆容量（圖2E）、遷移和入侵（圖2G），并增加了細胞凋亡率（圖2F）。相比之下，敲低或過表達SNHG25對子宮內膜癌細胞的增殖和凋亡幾乎沒有影響。

圖2 SNORD104敲低在體外抑制EC生長

3. SNORD104促進體外和體內EC進展

用SNORD104質粒穩(wěn)定轉染的HEC1B細胞（圖3A）表現(xiàn)出高增殖能力（圖3B-D），以及入侵和遷移速率的增加（圖3E）。此外，SNORD104過表達降低了HEC1B細胞的凋亡率（圖3F）。與體外結果一致，與接種空載體的對照細胞相比，穩(wěn)定表達SNORD104的HEC1B細胞在裸鼠中形成明顯更大的腫瘤（圖3G）。綜上所述，SNORD104的過表達顯著增強了體外EC細胞的增殖、侵襲和遷移，促進了體內腫瘤的生長。

圖3 SNORD104過表達促進體外和體內EC生長

4. SNORD0104通過促進2'O-甲基化上調和穩(wěn)定PARP1

SNORDs和H/ACA box snoRNA分別通過2'O-甲基化和假尿苷化調節(jié)基因表達。因此，作者假設SNORD104可能參與FBL介導的2'O-甲基化。事實上，使用抗FBL抗體對來自SNORD104過表達HEC1B細胞的裂解物的RIP測定顯示，免疫沉淀物中SNORD104顯著富集（圖4A）。然而，SNORD104過表達不影響FBL蛋白水平（圖4B)。

為了鑒定由SNORD104介導的2'O-甲基化調控的潛在靶基因，作者在對照和SNORD104過表達細胞中進行了NM-seq。如圖4C所示，2?-O-甲基化在928個甲基化位點（671個RNA）上調（倍數(shù)變化≥2）。據(jù)報道，小核仁RNA通常通過互補堿基配對來指導靶RNA的修飾。因此，作者將具有上調的 2'O-甲基化水平的 RNA 和具有 SNORD104 互補堿基配對片段的 RNA 相交。接下來，作者對這些高甲基化RNA進行了KEGG途徑富集分析。結果顯示，細胞凋亡相關通路排名第一。此外，作者分析了細胞凋亡途徑中的富集RNA，CPTAC數(shù)據(jù)庫顯示其編碼蛋白在子宮內膜癌組織中上調，包括ITPR3，LMNB1，PARP1，PARP4和TUBA1C。接下來，作者使用RIP測定來檢測FBL蛋白是否與這5個RNA結合，并使用蛋白質印跡來檢測由這5個RNA編碼的蛋白質是否發(fā)生變化。結果表明，只有PARP1 mRNA與FBL蛋白結合（圖4D），只有PARP1 mRNA和蛋白質水平發(fā)生變化（圖4E，F）。因此，作者接下來分析了術后EC組織中PARP1的表達，并觀察到SNORD104和PARP1表達水平之間存在正相關（圖4G）。PARP1主要位于細胞核中，參與DNA損傷修復和核糖體生物發(fā)生。與此一致，SNORD104過表達增加了核級分中的PARP1蛋白水平。此外，SNORD104過表達異種移植物也顯示出PARP1蛋白水平增加（圖4I，J）。

圖4 SNORD104在體外和體內上調PARP1表達

接下來進行RTL-P測定以檢測PARP1 mRNA中的2'-O-甲基化水平（圖5A）。敲低和過表達SNORD104分別降低和增加PARP1 mRNA的2'-O-甲基化水平（圖5B，C）。此外，SNORD104過表達HEC1B細胞中的FBL敲低降低了2'-O甲基化的PARP1 mRNA和PARP1蛋白水平（圖5D，F）。核糖2'-O-甲基化在mRNA中的生物學作用尚不清楚，盡管有報道稱它可以提高核酸對堿性或酶水解的穩(wěn)定性，最有可能通過改變其物理和化學性質。為了驗證這一假設，作者用轉錄抑制劑放線菌素D處理SNORD104過表達或敲低細胞。與對照組相比，SNORD104過表達細胞具有顯著更高的PARP1 mRNA穩(wěn)定性（圖5G），而敲低SNORD104或FBL降低了PARP1 mRNA的穩(wěn)定性（圖5H，I）。

圖5 SNORD104通過2'O-甲基化穩(wěn)定PARP1 mRNA

5. SNORD104通過調節(jié)PARP1促進EC生長

PARP1在各種癌癥中作為癌基因起作用。對TCGA和CPTAC數(shù)據(jù)集的搜索顯示，EC組織中的PARP1 RNA和蛋白質水平顯著增加（圖6A）。此外，Kaplan-Meier分析顯示PARP1的高表達與不良的總生存期相關（圖6B）。驗證SNORD104是否通過調節(jié)過表達SNORD104的HEC1B細胞中的PARP1、敲低FBL或PARP1發(fā)揮其致癌作用（圖6C）。正如預期的那樣，FBL或PARP1沉默逆轉了SNORD104對增殖（圖6D，E）、菌落形成（圖6F）和EC細胞的凋亡（圖6G）的影響。

圖6 敲低FBL或PARP1逆轉了SNORD104的致癌作用

結論：

SNORD104在EC中上調，并通過誘導PARP1的2'O-甲基化來促進腫瘤生長，從而增強后者的表達和生物學功能。該研究結果為EC發(fā)生和進展的機制提供了新的見解，并為個體化治療確定了新的治療靶點。

參考文獻：

Lu B, Chen X, Liu X, Chen J, Qin H, Chen S, Zhao Y. C/D box small nucleolar RNA SNORD104 promotes endometrial cancer by regulating the 2'-O-methylation of PARP1. J Transl Med. 2022 Dec 24;20(1):618. doi: 10.1186/s12967-022-03802-z.