硅藻硅化細胞壁的胞吐作用涉及廣泛的膜解體
硅藻是單細胞藻類，其細胞壁為硅質(zhì)。這些二氧化硅元素在膜結(jié)合的二氧化硅沉積囊泡中在細胞內(nèi)形成，并在完成后被胞吐。硅藻在這些大而硬的二氧化硅介質(zhì)的胞吐過程中如何維持膜穩(wěn)態(tài)仍然未知。本文利用活細胞共聚焦顯微鏡、透射電鏡和冷凍電子斷層掃描技術(shù)，研究了兩種硅藻模型物種的細胞壁形成和胞吐。結(jié)果表明，在其形成過程中，礦物相與二氧化硅沉積囊泡膜緊密結(jié)合，形成了精細幾何圖案的精確模具。在胞吐過程中，遠端二氧化硅沉積囊泡膜和質(zhì)膜逐漸與礦物分離，并在細胞外空間分解，沒有任何明顯的內(nèi)吞回收或細胞外再利用。在細胞內(nèi)，近端二氧化硅沉積囊泡膜成為細胞與其環(huán)境之間的新屏障，并承擔了新的質(zhì)膜的作用。這些結(jié)果提供了硅藻二氧化硅胞吐的直接結(jié)構(gòu)觀察，并指出了一種非凡的機制，其中膜穩(wěn)態(tài)是通過丟棄而不是回收，重要的膜補丁來維持的。本文于2023年1月發(fā)表于Nature Communications (IF=17.694)。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
(1) S. turris和T. pseudonana的形態(tài)學研究
我們通過研究兩種硅藻S. turris和T. pseudonana，研究了硅藻的瓣膜胞吐(圖1)。S. turris的瓣膜呈囊狀，有兩層結(jié)構(gòu)。近端層很薄，被納米級孔穿孔，遠端層被更高的層覆蓋，形成大的多邊形(圖1a’,a”)。多邊形層的頂部被壓平，在截面上形成“T”形(圖1a”’)。S. turris細胞形成鏈，通過從瓣膜頂端延伸的管狀連接二氧化硅延伸連接(圖1a，箭頭)。T. pseudonana細胞呈桶狀，體積小得多，閥瓣為直徑約5 μm(圖1b)。在徑向肋之間的硅層上有小孔，而較大的管狀孔裝飾著閥門的邊緣(圖1b’,b”)。圖1e,f顯示了在瓣膜形成期間和之后不久細胞的分裂。新形成的閥門用PDMPO染色，PDMPO是一種熒光染料，在生物礦化過程中摻入二氧化硅。將細胞大小與成熟瓣膜在胞吐前的大小進行比較，說明了這些堅硬的二氧化硅細胞壁胞吐所涉及的巨大挑戰(zhàn)(圖1g,h)。
圖1：S. turris和T.pseudonana的細胞結(jié)構(gòu)
(2) S. turris膜和二氧化硅動力學的活細胞成像
我們使用活細胞的延時共聚焦顯微鏡研究了S. turris的膜動力學(圖2)。在硅化過程中，PDMPO和FM4-64信號幾乎共定位到共聚焦顯微鏡的分辨率(圖2a)。這表明質(zhì)膜和SDV內(nèi)不斷增長的二氧化硅結(jié)構(gòu)之間非常接近，即質(zhì)膜襯SDV形狀。然而，連接延伸部分的生長尖端僅用膜染料染色，這表明SDV伸長先于其最邊緣部分的硅化(圖2a，箭頭)。
我們記錄了S. turris細胞在瓣膜形成和胞吐的整個過程中的膜動態(tài)延時(圖2b)。通過熒光質(zhì)膜可見瓣膜形成的過程，勾勒出不斷增長的多邊形二氧化硅層和連接延伸部分(圖2b, t=0到t=126)。胞外作用的開始，即質(zhì)膜-SDV-二氧化硅復合物的松動是明顯的，因為標記的質(zhì)膜不再清晰地勾勒出多邊形(圖2b, t=132)。
連接擴展段周圍的FM4-64信號在其生長過程中是連續(xù)的，但在擴展段達到完全大小后，熒光信號變?yōu)殚g斷的斑塊，逐漸消失(圖2b, t=156和t=234)。在某些情況下，圍繞連接延伸的膜明顯不再連接到細胞體(圖2b’)。FM4-64只標記結(jié)構(gòu)完整的膜，當膜被分解時，它將不再標記畸形的碎片。這些觀察指向了一種情況，遠端膜的主要部分完全脫離主細胞表面，逐漸解體，并在最近分裂的子細胞之間的細胞外空間失去熒光標記。
圖2：S. turris中的閥形成期間三維重建的時移共聚焦熒光圖像顯示協(xié)調(diào)二氧化硅和膜動力學
(3) S. turris中二氧化硅形成和胞吐的超微結(jié)構(gòu)
為了在超微結(jié)構(gòu)分辨率下觀察相同的過程，我們準備了分裂的S. turris細胞進行透射電鏡分析。S. turris細胞的透射電鏡圖像顯示，細胞環(huán)境的保存非常好，特別是SDV的膜和無機內(nèi)容物(補充圖未展示)。
我們從227個細胞在細胞周期的不同階段獲得了數(shù)百張圖像，分類和排序后重建了S. turris中瓣膜形成和胞外分泌的時間軸(圖3)。具有含有生長瓣膜的SDV的細胞被歸類為處于瓣膜形成階段(n=61，圖3a-b”)。遠端SDV膜與質(zhì)膜非常接近，距離僅為10-30nm(圖3a”，插圖)。在早期瓣膜形成期間，SDV僅延伸至硅沉積的深度(圖3a”)。多孔基層形成后，在其遠端形成多邊形層(圖3b-b”，箭頭)。當瓣膜仍然完全封閉在SDV中時，觀察到23個細胞，一個完整的SDV包含一個完全成熟的瓣膜(圖3c-c”)。
在68個細胞的圖像中，一個成熟的瓣膜被一些不連續(xù)的SDV膜包圍，即SDV沒有形成一個完整的外殼。我們定義這些細胞正在進行胞吐。這些膜的不連續(xù)可能是非常局部的，而大部分瓣膜仍然被SDV緊緊包圍(圖3d-d”)。遠端SDV和瓣膜周圍的質(zhì)膜的緊密描繪松動，觀察到遠端膜的結(jié)構(gòu)完整性惡化(圖3e-e”)。瓣膜近端膜現(xiàn)在與父瓣膜下的質(zhì)膜連續(xù)(圖3e”，箭頭)。在胞吐過程結(jié)束時，由于其位于親本束帶下，可以識別出新的瓣膜，而在細胞質(zhì)外看不到膜的可見痕跡(n=75，圖3f-f”)。
我們分析了新形成瓣膜附近的膜的顯微鏡數(shù)據(jù)，以確定可能與SDV膜回收有關(guān)的內(nèi)吞膜回收的跡象。觀察到7例胞吐期細胞膜內(nèi)陷的情況。這些內(nèi)陷的大小從0.5-3 μm不等(補充圖未展示)。然而，這種內(nèi)陷在瓣膜形成和胞吐的所有階段都有檢測，發(fā)生率相似(Χ2(df=2, N=152)=2.23, p=0.327)，因此與胞吐后膜循環(huán)無關(guān)。總的來說，在瓣膜胞吐過程中，遠端膜在細胞外解體，沒有恢復的跡象，而新瓣膜近端唯一可見的膜是SDV膜近端。
圖3：透射電鏡圖像顯示了S. turris的瓣膜形成和胞吐的順序階段
(4) T. pseudonana中二氧化硅胞吐的原生態(tài)納米級結(jié)構(gòu)
為了使細胞組織盡可能接近原生狀態(tài)，我們獲得了T. pseudonana細胞進行瓣膜胞吐的冷凍電子斷層掃描(cryo-ET)數(shù)據(jù)。使用驟降冷凍和聚焦離子束制備薄薄片，在低溫條件下收集電子層析圖，玻璃化同步T. pseudonana細胞。在59對成像的子細胞中，15對發(fā)生在瓣膜胞吐期間或后不久，即第一組束帶胞吐之前。其中4例發(fā)生在胞吐早期，新瓣膜僅部分被SDV膜覆蓋(圖4a-d)。
圖4a,c顯示了同對子細胞不同位置的斷層圖。左側(cè)的瓣膜仍然完全封閉在SDV內(nèi)，而右側(cè)的瓣膜已經(jīng)通過遠端膜覆蓋的不連續(xù)暴露在細胞外空間。在胞吐前的子細胞中，可以看到膜的預期排列：質(zhì)膜覆蓋整個細胞，并緊密地覆蓋在SDV膜下面，完全包圍瓣膜(圖4a,b，左側(cè))。然而，在胞吐過程中，遠端膜在多個部位融合，形成扁平膜囊網(wǎng)絡(luò)，使瓣膜近端膜成為細胞的最外層邊界(圖4a,b，右側(cè))。在瓣膜周圍也觀察到類似的情況，在翼狀口遠端可見不相連的膜性結(jié)構(gòu)(圖4c,d，右側(cè))。
在8對處于胞吐后期的細胞中，位于兩個子細胞最近胞吐的瓣膜和它們的束帶之間的大膜性囊泡(圖4e)。在剩下的三對最近有胞外瓣膜的細胞中，兩個子細胞之間沒有囊泡或膜殘留物。然而，在這三個細胞中，親代束帶并沒有包圍子細胞，這表明細胞周期的后期，所有細胞外碎片都被降解了。沒有一個成像的細胞含有發(fā)芽的內(nèi)吞囊泡或在瓣膜下形成新膜的跡象。低溫ET數(shù)據(jù)表明T. pseudonana使用與我們從S. turris收集的數(shù)據(jù)推斷的相同的胞吐機制，其中近端SDV膜被重新利用為新的質(zhì)膜，遠端膜在細胞外分解(圖4f)。
圖4：細胞內(nèi)冷凍ET顯示T. pseudonana瓣膜胞吐的原生狀態(tài)解剖
結(jié)論：
本文提出了硅藻二氧化硅胞吐的獨特機制。首先，細胞器膜被重新利用成為質(zhì)膜，其次，膜的大規(guī)模分解。這一機制被兩種模式硅藻物種所共享，可能是一種普遍機制。隨著硅藻遺傳研究工具箱的增長，很快就有可能研究參與這一事件的調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)機制，以及它與經(jīng)典胞吐的關(guān)系。
參考文獻：
deHaan, D., Aram, L., Peled-Zehavi, H., Addadi, Y., Ben-Joseph, O., Rotkopf, R., Elad, N., Rechav, K., & Gal, A. (2023). Exocytosis of the silicified cell wall of diatoms involves extensive membrane disintegration. Nature communications, 14(1), 480. https://doi.org/10.1038/s41467-023-36112-z.