長鏈非編碼RNA BC002811通過調(diào)控SOX2與PTEN啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移

胃癌是全球最常見的人類惡性腫瘤之一，每年有超過95萬的新發(fā)病例被診斷出來，尤其在東亞和東歐。盡管在過去的幾十年里，胃癌的放化療和手術(shù)取得了一些進(jìn)展，但仍有40%的胃癌患者發(fā)生轉(zhuǎn)移，其中只有5%的患者生存超過5年。因此，需要進(jìn)一步研究胃癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，以開發(fā)新的治療策略。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA在各種類型癌癥的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成和耐藥方面發(fā)揮核心作用。通過使用lncRNA芯片比較腫瘤和匹配的癌旁組織，作者之前證明了一些lncRNA在胃癌中異常表達(dá)。其中，lncRNA BC002811在胃癌組織中高表達(dá)。但BC002811在胃癌中的作用及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。該研究發(fā)表于《International Journal of Biological Sciences》，IF：10.75。

研究路線：

主要研究結(jié)果：

1. BC002811在胃癌中表達(dá)上調(diào)并與較差的生存率顯著相關(guān)

在之前的研究中，作者使用lncRNA芯片比較了胃癌樣本和匹配的鄰近非腫瘤樣本，發(fā)現(xiàn)BC002811在胃癌中表達(dá)上調(diào)。為了證實(shí)這一增加，作者利用組織微陣列，通過原位雜交在163對臨床胃癌樣本和鄰近非腫瘤胃組織中評估了BC002811的表達(dá)水平。BC002811染色強(qiáng)度分為陰性、弱、中或強(qiáng)（圖1A）。胃癌組織中的BC002811 ISH評分高于癌旁組織（圖1B）。此外，研究發(fā)現(xiàn)BC002811高水平與腫瘤大小、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。為了驗(yàn)證作者的發(fā)現(xiàn)，作者通過qPCR檢測了BC002811在31個(gè)配對的手術(shù)切除的人胃癌/癌旁組織以及4個(gè)胃癌細(xì)胞系和正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1中的表達(dá)。BC002811在胃癌組織中的表達(dá)始終高于相應(yīng)的癌旁組織（圖1C）。作者還發(fā)現(xiàn)，與GES-1細(xì)胞相比，BC002811在AGS、Hs746T、HGC-27和NCI-N87細(xì)胞中表達(dá)增加（圖1D）。采用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗(yàn)分析BC002811表達(dá)水平對胃癌患者總生存期（overall survival，OS）的影響，探討BC002811表達(dá)水平與胃癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系。BC002811高表達(dá)胃癌患者的中位OS為15個(gè)月，明顯短于低表達(dá)胃癌患者（圖1E）。

圖1lncRNA BC002811在胃癌組織中表達(dá)升高

2. BC002811在體外對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲具有顯著影響

通過轉(zhuǎn)染BC002811過表達(dá)載體和靶向BC002811的小干擾RNA，研究BC002811對胃癌細(xì)胞關(guān)鍵生物學(xué)特性的影響。MTS實(shí)驗(yàn)顯示，敲低BC002811后，AGS和HGC-27細(xì)胞的增殖能力減弱（圖2A）。與細(xì)胞增殖下降相一致，沉默BC002811的AGS和HGC-27細(xì)胞的克隆形成效率也明顯低于對照組細(xì)胞（圖2B）。相比之下，外源性表達(dá)BC002811可增加AGS和HGC-27細(xì)胞的增殖和集落形成（圖2A-B）。流式細(xì)胞術(shù)顯示，下調(diào)BC002811表達(dá)可誘導(dǎo)AGS和HGC-27細(xì)胞凋亡，而上調(diào)BC002811表達(dá)可降低細(xì)胞凋亡（圖2C）。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測BC002811對細(xì)胞侵襲和遷移的影響。過表達(dá)BC002811導(dǎo)致遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯增加，而敲低BC002811則產(chǎn)生相反的結(jié)果（圖2D）。BC002811的表達(dá)與胃癌細(xì)胞體外增殖、凋亡、侵襲和遷移密切相關(guān)。

圖2BC002811促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，抑制胃癌細(xì)胞凋亡

3. BC002811促進(jìn)胃癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤和轉(zhuǎn)移

裸鼠體內(nèi)注射穩(wěn)定敲低BC002811的HGC-27細(xì)胞、穩(wěn)定過表達(dá)BC002811的AGS細(xì)胞和相應(yīng)的對照細(xì)胞，觀察BC002811對胃癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤和轉(zhuǎn)移的影響。如圖3A-C，與注射對照細(xì)胞的小鼠相比，注射穩(wěn)定敲低BC002811細(xì)胞的小鼠顯示出明顯的腫瘤異種移植生長抑制。sh-BC002811組的腫瘤重量也明顯低于對照組（圖3D）。相反，BC002811的穩(wěn)定過表達(dá)增加了腫瘤生長（圖3A-D）。同樣，體內(nèi)尾靜脈轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BC002811穩(wěn)定敲低組動(dòng)物的肺轉(zhuǎn)移較少，而BC002811穩(wěn)定過表達(dá)組則相反，肺組織切片HE染色證實(shí)了這一點(diǎn)（圖3E-H）。這些數(shù)據(jù)表明，BC002811增加了致癌活性，并在體內(nèi)具有促進(jìn)轉(zhuǎn)移的作用。

圖3BC002811在體內(nèi)調(diào)節(jié)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移

4. MMP2、MMP9和PTEN是BC002811參與胃癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵下游靶點(diǎn)

為了進(jìn)一步研究可能參與BC002811促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移的基因，作者使用了人類腫瘤轉(zhuǎn)移qPCR芯片。如圖4A，在涉及人類腫瘤轉(zhuǎn)移的84個(gè)關(guān)鍵基因中，BC002811調(diào)控了3個(gè)差異表達(dá)基因（MMP2, MMP9和PTEN）。MMP2和MMP9是眾所周知的腫瘤轉(zhuǎn)移標(biāo)志物，而PTEN是一個(gè)特征明確的腫瘤抑制基因，在胃癌的轉(zhuǎn)移中起主要作用。qPCR顯示，在AGS和HGC-27細(xì)胞中過表達(dá)BC002811導(dǎo)致PTEN mRNA表達(dá)顯著降低，MMP2和MMP9 mRNA表達(dá)顯著升高，而敲低BC002811則產(chǎn)生相反的效果（圖4B）。蛋白質(zhì)印跡（圖4C）和免疫組織化學(xué)檢測（圖4D）進(jìn)一步證實(shí)了BC002811對這些基因的調(diào)控。這些結(jié)果證實(shí)了作者之前的發(fā)現(xiàn)，BC002811促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移。

圖4PTEN、MMP2和MMP9是BC002811的下游靶點(diǎn)

5. BC002811部分通過調(diào)控PTEN的表達(dá)來調(diào)控胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲

為了探究PTEN是否參與BC002811的促進(jìn)轉(zhuǎn)移功能，在胃癌細(xì)胞株AGS和HGC-27中過表達(dá)PTEN。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，上調(diào)PTEN抑制了AGS和HGC-27細(xì)胞的侵襲和遷移，而過表達(dá)BC002811逆轉(zhuǎn)了這一作用（圖5A）。與此一致，過表達(dá)BC002811還消除了PTEN介導(dǎo)的對MMP2/MMP9表達(dá)的抑制，以及MMP2/MMP9的酶活性（圖5B-E）。由于PTEN被認(rèn)為在胃癌轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)中具有關(guān)鍵功能，作者的研究結(jié)果表明，BC002811至少部分通過PTEN來調(diào)節(jié)胃癌的轉(zhuǎn)移。

                      圖5BC002811部分通過調(diào)控PTEN促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲

6. BC002811通過與SOX2相互作用抑制PTEN的表達(dá)

最近的研究報(bào)道，lncRNA通過與蛋白的相互作用，通過對癌基因或腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳調(diào)控影響胃癌轉(zhuǎn)移。為了探索BC002811是否通過這種方式影響胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，作者試圖通過RNA pull-down實(shí)驗(yàn)鑒定胃癌細(xì)胞中與BC002811相關(guān)的蛋白。經(jīng)SDS-PAGE和銀染后，對BC002811 pull-down特異性蛋白條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析（圖6A）。質(zhì)譜分析鑒定出的主要蛋白為轉(zhuǎn)錄因子SOX2（圖6B），這也被蛋白質(zhì)印跡法證實(shí)（圖6C）。為了進(jìn)一步證實(shí)BC002811與SOX2之間的相互作用，作者使用SOX2抗體進(jìn)行了RNA免疫沉淀。作者觀察到相對于IgG對照抗體，BC002811在SOX2抗體RIP中富集(圖6D)。此外，BC002811熒光原位雜交和SOX2免疫熒光顯示BC002811與SOX2在AGS和HGC-27細(xì)胞核中共定位（圖6E），表明BC002811可能通過與SOX2相互作用而在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮作用。PTEN是一個(gè)眾所周知的腫瘤抑制基因，已被證明是胃癌中SOX2轉(zhuǎn)錄調(diào)控的直接靶點(diǎn)。為了確定BC002811是否影響SOX2與PTEN啟動(dòng)子的結(jié)合，染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）和電泳遷移率移位測定（EMSA）分析在胃癌細(xì)胞中進(jìn)行。ChIP檢測表明，敲低BC002811增強(qiáng)了SOX2與PTEN啟動(dòng)子的結(jié)合（圖6F）。這也被EMSA進(jìn)一步驗(yàn)證（圖6G）。這些結(jié)果表明，BC002811可能作為SOX2的分子誘餌，直接與SOX2結(jié)合，從而阻止SOX2與PTEN啟動(dòng)子結(jié)合。為了驗(yàn)證BC002811是否通過SOX2介導(dǎo)抑制PTEN的表達(dá)，作者進(jìn)行了挽救實(shí)驗(yàn)。作者發(fā)現(xiàn)SOX2過表達(dá)在mRNA（圖6H）和蛋白水平（圖6I）逆轉(zhuǎn)了BC002811介導(dǎo)的PTEN表達(dá)降低。然而，敲低或上調(diào)BC002811均未改變SOX2 mRNA（圖6J）和蛋白表達(dá)（圖6K），因此排除了BC002811通過下調(diào)SOX2表達(dá)抑制PTEN轉(zhuǎn)錄的作用。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明BC002811可能通過與SOX2相互作用來抑制PTEN的轉(zhuǎn)錄。

圖6BC002811通過充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子SOX2的分子誘餌抑制PTEN的轉(zhuǎn)錄

7. 聯(lián)合BC002811和PTEN表達(dá)可提高預(yù)后價(jià)值

作者通過免疫組化和qPCR檢測PTEN在胃癌組織芯片配對樣本和手術(shù)切除的胃癌樣本中的表達(dá)，以評估臨床樣本中BC002811和PTEN水平之間的病理相關(guān)性。作者發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平低于其配對的非腫瘤胃標(biāo)本（圖7A-B）。同樣，PTEN的mRNA水平在胃癌樣本中也低于匹配的非腫瘤區(qū)域（圖7C）。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，BC002811的表達(dá)與PTEN蛋白（圖7D）和mRNA水平（圖7E）呈負(fù)相關(guān)，符合BC002811對PTEN表達(dá)的調(diào)控作用。PTEN表達(dá)對胃癌患者OS影響的結(jié)果顯示，PTEN低表達(dá)的胃癌患者預(yù)后稍差（圖7F）。為了獲得更好的臨床預(yù)后，作者根據(jù)BC002811和PTEN的表達(dá)水平將胃癌患者分為4個(gè)亞組。Kaplan-Meier分析顯示，這些亞組的生存模式顯著不同，其中BC002811表達(dá)上調(diào)和PTEN表達(dá)下調(diào)的患者的OS低于其他亞組（圖7G）。由于與低BC002811/高PTEN亞組相比，高BC002811/低PTEN亞組的OS顯著降低（圖7G），這表明BC002811和PTEN在胃癌預(yù)后中呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果還突出了合適的胃癌預(yù)后特征的臨床價(jià)值，而聯(lián)合檢測BC002811和PTEN表達(dá)可實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。

圖7BC002811表達(dá)聯(lián)合PTEN表達(dá)的預(yù)后意義

結(jié)論：

該研究鑒定出BC002811是一個(gè)參與胃癌生長和轉(zhuǎn)移的致癌lncRNA。該研究結(jié)果表明，BC002811與SOX2結(jié)合，破壞SOX2與PTEN啟動(dòng)子之間的相互作用，從而導(dǎo)致PTEN轉(zhuǎn)錄抑制。PTEN蛋白水平的降低可進(jìn)一步刺激MMP2和MMP9的表達(dá)，最終促進(jìn)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。該研究為腫瘤細(xì)胞BC002811靶向治療胃癌轉(zhuǎn)移提供了潛在的策略。

示意圖：

BC002811調(diào)控PTEN表達(dá)和胃癌轉(zhuǎn)移的模型。

參考文獻(xiàn)：

Lin X, Li G, Yan X, Fu W, Ruan J, Ding H, et al. Long non-coding RNA BC002811 Promotes Gastric Cancer Metastasis by Regulating SOX2 Binding to the PTEN Promoter.Int J Biol Sci. 2023 Jan 16;19(3):967-980. doi: 10.7150/ijbs.76407.