單細(xì)胞RNA測序揭示了膠質(zhì)瘤小鼠模型惡性進(jìn)展過程中免疫抑制髓細(xì)胞多樣性

近年來的研究表明，動態(tài)腫瘤微環(huán)境(TME)在高級別膠質(zhì)瘤(HGGs)中的重要性。具體而言，髓系細(xì)胞在膠質(zhì)瘤中介導(dǎo)免疫抑制。然而，髓系細(xì)胞是否在低級別膠質(zhì)瘤(LGG)惡性進(jìn)展中發(fā)揮作用尚不清楚。在本研究中，我們利用單細(xì)胞RNA測序在小鼠膠質(zhì)瘤模型中研究了TME的細(xì)胞異質(zhì)性，該模型重現(xiàn)了從LGG到HGG的惡性進(jìn)展，為具有惡性進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的LGG患者提供治療機(jī)會。該研究發(fā)表在《CELL REPORTS》，IF：9.995。

研究方法：細(xì)胞培養(yǎng)、組織樣本收集、單細(xì)胞測序、H&E染色、隨機(jī)森林建模、IPA分析、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光、Opal、qPCR、生存分析

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. scRNA-seq識別膠質(zhì)瘤進(jìn)展過程中的動態(tài)免疫細(xì)胞異質(zhì)性

未成熟的髓系來源細(xì)胞可能限制T細(xì)胞浸潤和活化，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤的免疫抑制。為了研究髓系細(xì)胞群的異質(zhì)性以及在LGG惡性進(jìn)展過程中TME中這種多樣性的功能后果，我們使用了小鼠PDGF-B-驅(qū)動的RCAS膠質(zhì)瘤模型。該模型在大約3 ~ 4周開始形成LGGs，在大約6 ~ 8周進(jìn)展為HGGs(圖1A)。我們通過流式細(xì)胞術(shù)檢測CD11b和Gr1 (Ly6c/Ly6g)(一種小鼠髓源性抑制細(xì)胞的標(biāo)志物)，確定了在特定時間點(diǎn)荷瘤動物骨髓中髓系細(xì)胞的比例。CD11b+Gr1+細(xì)胞增加與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。然而，我們的觀察闡明了在攜帶膠質(zhì)瘤的動物中，骨髓中CD11b+Gr1+細(xì)胞擴(kuò)增的初始時間。

為了研究腫瘤進(jìn)展過程中髓系細(xì)胞類型特異性的轉(zhuǎn)錄變化，我們對來自無腫瘤動物(NTs;n = 2)、LGG (n = 3)和HGG (n = 3)，使用10× Genomics平臺(圖1B)。在包含所有樣本12,668個細(xì)胞的整合數(shù)據(jù)集中，我們共識別出15個不同的細(xì)胞簇，這些細(xì)胞簇包括不同的小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血小板和未成熟紅細(xì)胞群(圖1C)。我們通過表達(dá)每種細(xì)胞類型的典型標(biāo)記(使用點(diǎn)圖(圖1D)和特征圖(圖1E)可視化)來驗(yàn)證細(xì)胞簇的身份。

圖1惡性進(jìn)展過程中腫瘤浸潤白細(xì)胞的單細(xì)胞RNA測序

為了確定膠質(zhì)瘤進(jìn)展過程中的免疫細(xì)胞景觀動態(tài)，我們評估了NT、LGG和HGG的髓樣和淋巴樣細(xì)胞分布和異質(zhì)性(圖2A)。我們將巨噬細(xì)胞分為以下4種亞型:邊界相關(guān)巨噬細(xì)胞(BAMs)、膠質(zhì)瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(GAMs)、巨噬細(xì)胞和中間單核/巨噬細(xì)胞(Int Mos/Macs)。我們觀察到，與LGG(4.7%)相比，HGGs中GAMs的比例(以Gpnmb和Spp1表達(dá)為標(biāo)記)增加(20.8%)(圖2A和2B)。我們發(fā)現(xiàn)，與NT組(3.5%)相比，LGGs組(9.4%)和HGGs組(8.8%)的Int Mos/ mac均增加。在HGGs中，GAMs的增加也伴隨著T細(xì)胞比例的降低(圖2A和2B)。這些數(shù)據(jù)提示，髓系介導(dǎo)的T細(xì)胞募集或擴(kuò)增抑制。為了驗(yàn)證這些結(jié)果，我們對低級別和高級別胃癌的腫瘤浸潤免疫細(xì)胞進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)檢測。我們定量了CD45+細(xì)胞中CD45hiCD11b+細(xì)胞的百分比，通常被識別為BMDM細(xì)胞。我們檢測到HGGs中BMDM細(xì)胞的百分比(11.5%±4.5%)比LGGs(2.7±1.5%)增加了4倍(圖2C和2D)。我們觀察到LGGs中CD45+細(xì)胞內(nèi)淋巴細(xì)胞(CD11b?CD45hi)的比例(26.9%±12%)明顯高于HGGs(9%±6.6%;p = 0.0197)(圖2F)。我們還計(jì)算了淋巴細(xì)胞:BMDM細(xì)胞(CD45+細(xì)胞內(nèi))在LGG和HGG中的比例。LGGs中CD45+細(xì)胞的淋巴細(xì)胞:BMDM細(xì)胞比率(10.4±3.8)明顯高于HGGs(0.76±0.34)。這進(jìn)一步證實(shí)了在HGGs中CD45+細(xì)胞中的淋巴細(xì)胞群比例減少(圖2F)。在63.5%±7%的LGGs和87.3%±5.1%的HGGs中，CD45hiCD11b+細(xì)胞也表達(dá)巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80(圖2C和2D)。在CD45hiCD11b+細(xì)胞中，LGG動物(5.5%±3.2%)和HGG動物(10.9%±4.3%)的CD11b+Gr1+細(xì)胞(髓源性抑制細(xì)胞)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2D)。此外，我們通過流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證了患有LGG和HGG的動物大腦中存在T細(xì)胞(圖2E)。我們發(fā)現(xiàn)LGGs中淋巴細(xì)胞群中的T細(xì)胞(CD45hiCD11b?)(78.5%±1.4%)明顯高于HGGs(43.4%±11.3%)。同樣，在淋巴細(xì)胞群體中，LGGs的CD8+ T細(xì)胞比例(33%±6.2%)明顯高于HGGs(8.6%±10.9%)(圖2F)。這些結(jié)果支持了我們的scRNA-seq數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)也顯示了HGGs中T細(xì)胞浸潤減少。

在正常大腦中觀察到的主要免疫細(xì)胞類型是小膠質(zhì)細(xì)胞，81.2%的免疫細(xì)胞聚集為小膠質(zhì)細(xì)胞。相比之下，LGG和HGG中分別只有41%和48.3%的免疫細(xì)胞是小膠質(zhì)細(xì)胞(圖2A、2B)。在正常大腦中無法檢測到激活的小膠質(zhì)細(xì)胞群;然而，它們分別占LGGs和HGGs的9%和8.5%(圖2A和2B)。

圖2單細(xì)胞RNA測序顯示膠質(zhì)瘤進(jìn)展過程中免疫細(xì)胞浸潤的差異

2. 惡性進(jìn)展過程中巨噬細(xì)胞采用免疫抑制轉(zhuǎn)錄信號

我們的scRNA-seq分析確定了4個不同的巨噬細(xì)胞簇。BAM和Int Mos/Macs表達(dá)BMDM細(xì)胞的獨(dú)特特征(Tgfbi、Cd14和Itga4)(圖3A)，相比之下，GAM和巨噬細(xì)胞簇表達(dá)了微膠質(zhì)來源的巨噬細(xì)胞的特征(Trem2、Cd9、Cd81、Ctsb、Ctsd和Ctsd)，并表現(xiàn)出BMDM相關(guān)基因的顯著下調(diào)特征(圖3A)。

BAMs主要參與CNS邊緣區(qū)域的清除功能，而已知巨噬細(xì)胞的其他亞群也存在于TME中。因此，我們的進(jìn)一步分析將主要關(guān)注非BAMs巨噬細(xì)胞亞群，它們在腦TME的背景下更相關(guān)。對GAMs、巨噬細(xì)胞和Int Mos/Macs的聯(lián)合分析表明，HGGs中免疫抑制因子(Mif、Lgals3、Pkm、Axl、Id2和Ccl4)水平較高，而LGGs中募集因子(Ccl5、Cxcl9和Cxcl10)和M1基因(Stat1、HLAII (H2-Aa)和IL-1β)顯著表達(dá)(圖3B)。

圖3膠質(zhì)瘤進(jìn)展過程中巨噬細(xì)胞簇的異質(zhì)性

3. 惡性進(jìn)展過程中的異質(zhì)性和不同的巨噬細(xì)胞簇功能

與NT相比，GAM在LGG中Cd74、MhcII (H2-Aa)基因和Stat1表達(dá)水平升高，在HGG中ApoE、ApoC1和Timp2表達(dá)水平升高(圖3C)。與NT相比，LGG中巨噬細(xì)胞Cd74和MHCII (H2-Aa)基因表達(dá)水平升高(圖3E)。與LGG相比，在HGGs中ApoE、Timp2、Cd63和Ctsd上調(diào)(圖3E)。與GAMs相似，LGG和HGG中巨噬細(xì)胞簇的Cd74和Mif表達(dá)水平也明顯高于NT (p < 0.005)(圖3F)。附圖4至附圖9顯示：IPA分析發(fā)現(xiàn)，與NT相比，LGG的巨噬細(xì)胞簇中TNF、IFNG、TREM2和STAT1被激活。與LGG相比，HGG下調(diào)IFNG和STAT1，上調(diào)CSF1、PPARG和IL-10RA。在Int Mo/Mac聚類中，ApoE、Apoc1、Ctsd、Spp1和Timp2是HGG中差異表達(dá)前20位的基因。相比之下，趨化因子Ccl5、Ccl8和Cxcl9是該類群中LGG中差異表達(dá)最多的基因。IPA分析發(fā)現(xiàn)，與NT相比，LGG中IFNG和STAT1相關(guān)通路上調(diào)。另一方面，與LGG相比，HGG中IL-10RA、PTGER4和PPARG被激活，而IFNG、STAT1和IFNG下調(diào)。我們在HGG中GAM和Int Mo/Mac聚類中發(fā)現(xiàn)了前20個上調(diào)基因中的Spp1。同樣，Gpnmb是HGG中GAMs中上調(diào)最多的基因之一。隨后，我們發(fā)現(xiàn)GAMs中同時表達(dá)M1和M2標(biāo)記物。此外，在GAMs、巨噬細(xì)胞和Int Mos/ mac中的轉(zhuǎn)錄譜顯示出較高的預(yù)測價值，并且在腫瘤進(jìn)展期間顯示出免疫抑制進(jìn)化。我們在GAMs中發(fā)現(xiàn)了Apoc1和ApoE，在巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了Cd74和MHCII，在Int Mo/Mac人群中發(fā)現(xiàn)了MHCII、Cd74、M1極化標(biāo)簽Stat和趨化因子Ccl5。

4. CD74-MIF軸作為腫瘤浸潤巨噬細(xì)胞的靶點(diǎn)

鑒于所有3個巨噬細(xì)胞簇似乎都表現(xiàn)出免疫抑制特性，我們確定了LGG期的常見標(biāo)記物，值得進(jìn)一步的功能研究。與NT相比，LGG和HGG樣本中的GAMs和巨噬細(xì)胞中Cd74及其結(jié)合伙伴Mif的表達(dá)均顯著上調(diào)(圖3D和3F)。同樣，與LGG相比，GAMs和巨噬細(xì)胞中促血管生成驅(qū)動因子Id2和免疫抑制分子Lgals3在HGG中顯著上調(diào)(圖3D和3F)。

為了評估CD74在荷瘤動物中的原位表達(dá)，我們對NT、LGG和HGG的組織切片進(jìn)行了CD74和CD68的聯(lián)合染色，并進(jìn)行了全腫瘤組織成像，共分析了367個FOVs。我們發(fā)現(xiàn)，與NT(0.07%±0.2%)相比，HGG(3.4%±5.8%)和LGG(1.4%±2.9%)的CD74陽性細(xì)胞比例顯著增加(圖3G)。然后，我們用qPCR方法驗(yàn)證了從TME分離的免疫細(xì)胞中Cd74和Id2的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)與LGG相比，HGG中Cd74和Id2的表達(dá)明顯增加(圖3H)。流式細(xì)胞術(shù)染色也顯示，與LGG(3.9%±1.7%)相比，HGGs在CD45hiCD11b+細(xì)胞中過表達(dá)CD74(31.9%±16.2%)(圖3I)。我們在LGG和HGG患者中均發(fā)現(xiàn)CD74+CD206+細(xì)胞。然而，LGG患者的CD74+CD206+細(xì)胞數(shù)量顯著增加(圖3J)，證實(shí)了浸潤性人腦膠質(zhì)瘤巨噬細(xì)胞中CD74的表達(dá)。

5. HGG TME中T細(xì)胞運(yùn)輸和激活的限制

我們觀察到，與HGG樣本相比，LGG中的T細(xì)胞浸潤增加(圖2B和S2A)。CD3+ T細(xì)胞占LGGs免疫浸潤的6.4%，而在每個樣本中，正常腦和HGGs的CD3+ T細(xì)胞比例分別不到0.08%和2.1%(圖2B和S2A)。為此，差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在LGG的浸潤T細(xì)胞中，趨化因子(如Ccl8、Cxcr6、Ifn-γ和Ccl5)上調(diào)(圖S11)。相比之下，HGG中的免疫浸潤T細(xì)胞表達(dá)更多與脂質(zhì)代謝相關(guān)的分子，如ApoE、Apoc1、Hmox和Fabp5(圖4A)。

接下來，我們研究了低級別GGS和高級別GGS之間總CD3+ T細(xì)胞的基因表達(dá)差異。LGGs中的總T細(xì)胞還表達(dá)顯著增加的T細(xì)胞活化標(biāo)記Ifn-γ水平(圖4B和4H)。與HGG和NT相比，T細(xì)胞共刺激分子Cd28和Th1轉(zhuǎn)錄因子Tbx21在LGG中也上調(diào)，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(圖4B和4H)。相比之下，HGG中的總T細(xì)胞表達(dá)的T細(xì)胞活化標(biāo)志物(Cd69和Ifn-γ)和效應(yīng)記憶標(biāo)志物(Cd44)顯著少于LGG(圖4B和4H)。

CD4+ T細(xì)胞在LGG中表達(dá)的T細(xì)胞活化標(biāo)志物Cd69明顯高于HGG (p < 0.05)。相比之下，CD4+ T細(xì)胞惡性進(jìn)展為HGG后，T細(xì)胞抑制標(biāo)志物Pdcd1、Lgals3、Lag3、Havcr2 (Tim3)、Th2轉(zhuǎn)錄因子(Gata3)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)標(biāo)志物(Foxp3)均出現(xiàn)增加(圖4C);然而，可能由于細(xì)胞計(jì)數(shù)非常低，沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在CD8+ T細(xì)胞中，我們觀察到HGG中Cd28和Cd69的表達(dá)明顯低于LGG(圖4D)?？?/span>T細(xì)胞的IPA分析也發(fā)現(xiàn)了Th1極化和細(xì)胞毒性的抑制(圖4E)。IFNG和IRF3是HGG和LGG中下調(diào)最多的預(yù)測通路，而cite 2、IL-10RA和STAT6是HGG和LGG中上調(diào)最多的預(yù)測通路(圖4F)。接下來，我們使用X細(xì)胞對TCGA數(shù)據(jù)集進(jìn)行反褶積分析，研究了LGG (n = 33)和HGG (n = 58)患者之間CD8 T細(xì)胞計(jì)數(shù)和自然殺傷細(xì)胞(NK)計(jì)數(shù)的差異(圖4G)。我們發(fā)現(xiàn)LGG患者的CD8+ T細(xì)胞和NK細(xì)胞富集評分顯著高于HGG患者，這與我們從RCAS-Ntva模型中得到的結(jié)果一致。

總之，我們在RCAS-Ntva模型中的結(jié)果以及在人類組織/數(shù)據(jù)集中的驗(yàn)證支持，在腫瘤進(jìn)展到HGG時，TME內(nèi)的免疫抑制巨噬細(xì)胞簇可能限制了T細(xì)胞的功能和浸潤(圖4H)。

圖4攜帶HGG的動物T細(xì)胞活化受損

結(jié)論：

我們的數(shù)據(jù)表明，巨噬細(xì)胞在低級別腫瘤階段表現(xiàn)出免疫激活的特征，并在腫瘤轉(zhuǎn)化為高級別時獲得免疫抑制特征。在LGG和HGG之間的動態(tài)階段，針對巨噬細(xì)胞的功能研究可能消除免疫抑制機(jī)制，并為阻止惡性進(jìn)展提供治療機(jī)會。

參考文獻(xiàn)

Rajendran S, Hu Y, Canella A, et al. Single-cell RNA sequencing reveals immunosuppressive myeloid cell diversity during malignant progression in a murine model of glioma. Cell Rep. 2023; 42(3):112197. doi: 10.1016/j.celrep.2023.112197.