順鉑誘導(dǎo)可變剪接的機(jī)制初探

pre-mRNA的選擇性剪接（AS）是真核生物基因表達(dá)中的一個(gè)關(guān)鍵分子事件。AS控制轉(zhuǎn)錄組的定性多樣性，并擴(kuò)展蛋白質(zhì)組的功能庫。此外，癌癥治療中使用的基因毒劑會(huì)引起癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的重編程。這些變化反映了細(xì)胞對壓力的反應(yīng)，是導(dǎo)致一些耐藥性機(jī)制的基礎(chǔ)。本研究分析了順鉑在乳腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)的pre-mRNA剪接的全基因組變化。本研究于2022年12月發(fā)表在《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》IF：19.160期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、順鉑處理影響mRNA水平和pre-mRNA間接

為描述癌細(xì)胞中與DNA損傷相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組變化，用順鉑（50 μM，24h）處理MCF-7乳腺癌細(xì)胞，并與未處理的對照組進(jìn)行RNA-seq對比分析。選擇MCF-7細(xì)胞是因?yàn)樗鼈儽徽J(rèn)為對這種基因毒性藥物具有相對抗性。差異分析顯示，順鉑處理后共有2310個(gè)RNA存在差異表達(dá)（DE），其中絕大多數(shù)為mRNA，且整體上看順鉑對轉(zhuǎn)錄本的下調(diào)略多于上調(diào)（圖1A）。針對“Hallmarks MSigDB集合”對DEmRNA進(jìn)行GSEA，發(fā)現(xiàn)NF-κB和p53通路具有最高的陽性富集評(píng)分，MYC靶標(biāo)和G2/M相關(guān)基因是最高的陰性富集評(píng)分（圖1B）。GO分析顯示，DEmRNA在多個(gè)與DNA損傷應(yīng)答（DDR）激活兼容的生物過程中富集，包括“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”、“凋亡過程的正向調(diào)控”、“細(xì)胞對DNA損傷刺激的反應(yīng)”或“DNA損傷反應(yīng)，p53類介質(zhì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯”（圖1C）。

AS分析發(fā)現(xiàn)，在順鉑處理的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中，共有2922個(gè)AS事件影響1873個(gè)mRNA（圖1D）。其中，選擇性剪接外顯子（a-SE，也稱為盒式外顯子）是目前為止最常見的，占總變化的69.9%，影響1433個(gè)mRNA。順鉑誘導(dǎo)的a-SE的mRNA在與DNA修復(fù)和復(fù)制、鏈間交聯(lián)修復(fù)、細(xì)胞-細(xì)胞粘附和mRNA加工包括剪接等相關(guān)的生物過程中顯著富集（圖1E）。值得注意的是，在受順鉑影響的基因中，只有10.7%（197/1832）含有順鉑依賴的a-SE（圖1F）。此外，與a-SE相關(guān)的差異剪接基因（DSG）相關(guān)的GO與DEG相關(guān)的GO不同，這表明順鉑的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后（例如剪接）效應(yīng)針對不同的基因組（圖1C與圖1E比較）。

圖1順鉑誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞中大量轉(zhuǎn)錄組改變

2、順鉑誘導(dǎo)缺乏E4和5的COASY短異構(gòu)體的表達(dá)

在試圖將順鉑對AS的影響與耐藥機(jī)制聯(lián)系起來時(shí)，作者將注意力轉(zhuǎn)向了與線粒體功能相關(guān)的基因。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)9.2%（132/ 1433）的轉(zhuǎn)錄本經(jīng)過順鉑介導(dǎo)的a-SE編碼了MitoCarta 3.0（人類線粒體蛋白質(zhì)和途徑數(shù)據(jù)庫）中列出的蛋白質(zhì)；相比之下，只有4.5%的DEG（84/1832）編碼MitoCarta數(shù)據(jù)庫中存在的蛋白質(zhì)，這表明順鉑可能優(yōu)先通過AS影響線粒體相關(guān)轉(zhuǎn)錄本。在132個(gè)與線粒體功能相關(guān)的AS轉(zhuǎn)錄本中，作者重點(diǎn)研究COASY，它編碼輔酶A合成酶。RNA-seq分析顯示，在順鉑處理后，COASY經(jīng)歷了一個(gè)復(fù)雜的AS事件，包括兩個(gè)連續(xù)的a-SE（外顯子4和5，E4-5）的跳躍，但是它的表達(dá)在mRNA水平和蛋白均未改變（圖2A）。COASY轉(zhuǎn)錄本中E4-5的跳躍會(huì)生成一個(gè)較短的COASY亞型，與全長亞型同框，但缺乏獨(dú)特的ATP結(jié)合位點(diǎn)，因此缺乏催化活性。作者利用位于上游外顯子3和下游外顯子6的外顯子的引物，采用異構(gòu)體識(shí)別終點(diǎn)RT-PCR驗(yàn)證了COASY E4-5的跳躍（圖2A）。該方法可以同時(shí)擴(kuò)增缺乏和含有E4-5的COASY mRNA異構(gòu)體，以下分別稱為COASY-short和COASY-FL，并計(jì)算剪接比（SOR，即short/FL）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞主要表達(dá)FL亞型，如SOR值<1，順鉑處理導(dǎo)致短變異比例以劑量和時(shí)間依賴的方式增加（圖2B，C）。此外，其他DNA損傷藥劑也可誘導(dǎo)COASY E4-5的跳躍，只是程度不同（圖2D）。同樣，COASY E4-5剪接模式改變的強(qiáng)度與DNA損傷劑對細(xì)胞活力的影響相關(guān)。喜樹堿和阿霉素對COASY E4-5的影響最強(qiáng)，對MCF-7細(xì)胞的毒性也最高（圖2E）。相反，依托泊苷和H₂O₂對MCF-7活性的影響較小，對E4-5包合物水平無影響（圖2E）。這些觀察結(jié)果表明，長異構(gòu)體和短異構(gòu)體之間的剪接開關(guān)可能與對DNA損傷劑的敏感性有關(guān)。為驗(yàn)證這一點(diǎn)，作者比較了COASY E4-5在同源的順鉑敏感和耐藥的卵巢癌（分別為A2780 A和A2780 DDP）、回盲腺癌（分別為HCT8 A和HCT8 DDP）的細(xì)胞株中的剪切模式。在兩種細(xì)胞類型中，敏感細(xì)胞對順鉑的反應(yīng)中，COASY E4-5的跳躍增加，導(dǎo)致更多的COASY-short亞型（圖2F-G）。相比之下，在耐藥細(xì)胞中COASY E4-5剪接不受順鉑影響?？傊?，這些觀察結(jié)果表明COASY短亞型的表達(dá)與順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡相關(guān)。

圖2由順鉑或其它DNA損傷藥物誘導(dǎo)的COASY-短亞型缺失E4和E5

3、缺乏E4-5的COASY-short亞型下調(diào)改變線粒體的形狀、功能和順鉑敏感性

為確定COASY-short亞型是否在順鉑敏感性中起作用，通過異位表達(dá)或敲除實(shí)驗(yàn)調(diào)節(jié)其水平。免疫熒光成像顯示，異位表達(dá)的COASY-FL或-short亞型主要定位于線粒體（圖3A）。該實(shí)驗(yàn)也揭示了過表達(dá)的COASY-short顯著改變了線粒體網(wǎng)絡(luò)，表現(xiàn)為拉長的相互連接的線性結(jié)構(gòu)。對具有“管狀”或“碎片狀”表型的細(xì)胞進(jìn)行定性視覺檢查和計(jì)數(shù)，這是一種常規(guī)用于評(píng)估線粒體形態(tài)的方法，證實(shí)了短亞型的表達(dá)使裂變/融合平衡傾斜，有利于融合和“管狀”形態(tài)（圖3B）?；谶@些觀察，接下來通過功能喪失實(shí)驗(yàn)評(píng)估COASY-short亞型在順鉑誘導(dǎo)的線粒體動(dòng)力學(xué)和功能變化中的作用。為此，設(shè)計(jì)了兩個(gè)針對E3-E6連接的siRNA，從而特異性靶向短亞型，而對全長轉(zhuǎn)錄本或蛋白沒有影響。通過冷凍電子顯微鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)COASY-short敲除的細(xì)胞的嵴密度降低和線粒體腫脹（圖3C）。和文獻(xiàn)報(bào)道一致，順鉑促進(jìn)線粒體融合，并顯著影響對照MCF-7細(xì)胞的線粒體網(wǎng)絡(luò)，表現(xiàn)為管狀線粒體的細(xì)胞百分比從沒有順鉑時(shí)的20%上升到順鉑暴露后的80%以上（圖3D，E）。值得注意的是，在COASY-short表達(dá)抑制的細(xì)胞中，順鉑對線粒體裂變/融合動(dòng)力學(xué)的影響被廢除，表現(xiàn)為這些細(xì)胞中的大多數(shù)在順鉑處理后保留了碎片化的線粒體網(wǎng)絡(luò)?？傊?，這些實(shí)驗(yàn)表明，順鉑誘導(dǎo)的線粒體變化最有可能是由于COASY-short的表達(dá)，而不是由于COASY-FL。

由于COASY-short亞型促進(jìn)線粒體融合，接下來通過測量氧化磷酸化來評(píng)估因COASY-short敲除的細(xì)胞的線粒體功能。與對照組比較，在COASY-short亞型敲除的情況下，無論是未處理的還是順鉑處理的細(xì)胞，耗氧率（OCR），包括與ATP生成相關(guān)的OCR都降低了（圖3F，G）。此外，在沒有順鉑的情況下，COASY-short亞型的缺失對MCF-7的健康和活力沒有影響，但顯著降低順鉑的細(xì)胞毒性作用，并增加了細(xì)胞耐藥性（圖3H，I）。這些結(jié)果表明，COASY短亞型的缺失會(huì)降低線粒體融合和活性，并且順鉑誘導(dǎo)會(huì)改變AS事件，例如產(chǎn)生COASY-short亞型，從而作用于其毒性。

圖3 MCF-7細(xì)胞中COASY-短亞型誘導(dǎo)線粒體融合和凋亡

4、RBM39的失活介導(dǎo)了順鉑對AS的很大一部分作用

接下來，以COASY E4-5的跳躍為典型事件揭示順鉑調(diào)控AS的分子機(jī)制。在順鉑誘導(dǎo)的1832個(gè)DE mRNA中，只有9個(gè)（3個(gè)上調(diào)，6個(gè)下調(diào)）被注釋到“mRNA通過剪接體剪接”（圖1）。這使得順鉑不太可能通過調(diào)節(jié)剪接調(diào)控因子的表達(dá)間接影響AS，雖然這仍然是一種可能性。為鑒定順鉑驅(qū)動(dòng)AS的潛在效應(yīng)因子，使用先前驗(yàn)證的siRNA敲除了56個(gè)潛在的剪接調(diào)控因子，并通過RT-PCR在未處理的MCF-7中監(jiān)測COASY的E4-5的包含情況。COASY E4-5包合的差異統(tǒng)計(jì)為敲除細(xì)胞和對照細(xì)胞的拼接百分比的差異（圖4A）。為最大限度地提高識(shí)別相關(guān)剪接因素的機(jī)會(huì)，只考慮導(dǎo)致剪接變化超過20%的敲除，其中，SF3A1、RBM39和SF3B4的影響最為明顯（圖4A）。SF3A1和SF3B4都是與U2 snRNP相關(guān)的剪接因子，耗盡這些一般的剪接因子預(yù)計(jì)會(huì)非特異性地影響許多替代外顯子的剪接。RBM39是一個(gè)著名的RNA結(jié)合蛋白，已被證明可以調(diào)節(jié)幾個(gè)基因的替代剪接。因此，作者將注意力集中在RBM39上，并測試其可能參與順鉑依賴性調(diào)節(jié)特定AS的假設(shè)。首先，使用兩種不同的siRNA驗(yàn)證了RBM39的缺失促進(jìn)了E4-5的缺失，與順鉑類似（圖4B）。為測試這種影響是否僅限于COASY，用siRBM39#2敲除RBM39，并通過RNA-seq分析在全基因組范圍內(nèi)分析了相關(guān)的剪接變化。結(jié)果顯示RBM39下調(diào)對AS影響較大，共導(dǎo)致7131起AS事件，其中最多的是a-SE（圖4C）。通過比較RBM39依賴的和順鉑誘導(dǎo)的SE，在468個(gè)獨(dú)立基因上鑒定出577個(gè)事件，占所有順鉑誘導(dǎo)SE的28.2%（577/2045），這表明近三分之一順鉑誘導(dǎo)的a-SE也由RBM39控制（圖4D）。引人注目的是，這577個(gè)事件中的88%（24.8%E4-5排除率降低，63.6% E4-5排除率增加）受到RBM39基因敲除或順鉑治療的類似影響，而只有12%受到相反的調(diào)節(jié)（圖4E）。通過RT-PCR分析一系列SEs，驗(yàn)證了RBM39缺失和順鉑處理對類似陽性和陰性定性轉(zhuǎn)錄調(diào)控的例子（圖4F）。與順鉑類似，敲除RBM39可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，但下調(diào)RBM39并沒有進(jìn)一步提高順鉑的死亡率（圖4G）。這些結(jié)果說明順鉑誘導(dǎo)AS事件很大一部分依賴于RBM39。

圖4大部分順鉑依賴SE修飾都受RBM39調(diào)控

5、順鉑促進(jìn)了c-Jun和RBM39之間的聯(lián)系，并通過減少RBM39與COASY pre-mRNA的結(jié)合來控制COASYE4-5的排斥

由于RBM39的缺失和順鉑處理對COASY E4-5的包含有類似的影響，所以作者假設(shè)順鉑可能導(dǎo)致RBM39失活。由于作者發(fā)現(xiàn)順鉑不能影響RBM39的mRNA和蛋白表達(dá)，也不能影響其亞細(xì)胞定位。所以，作者在研究順鉑與RBM39之間的聯(lián)系時(shí)，將注意力轉(zhuǎn)向了二聚體AP-1 TF的主要成分c-Jun，因?yàn)镽BM39與可c-Jun特異性結(jié)合，并作為AP-1的轉(zhuǎn)錄共激活劑。重要的是，文獻(xiàn)報(bào)道c-Jun可被順鉑激活，通過其反式活化結(jié)構(gòu)域（TAD）的磷酸化和轉(zhuǎn)錄上調(diào)，并參與了幾種癌癥的順鉑耐藥機(jī)制。所以，作者假設(shè)c-Jun可能會(huì)干擾RBM39依賴的剪接。首先，通過共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，在未處理和順鉑處理的MCF-7細(xì)胞中監(jiān)測c-Jun與RBM39的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在沒有順鉑的情況下，c-Jun和RBM39之間沒有免疫共沉淀，而順鉑處理導(dǎo)致了兩種蛋白質(zhì)之間的強(qiáng)大關(guān)聯(lián)（圖5A）。為驗(yàn)證順鉑誘導(dǎo)的RBM39和c-Jun之間的關(guān)聯(lián)不僅僅是c-Jun水平增加的結(jié)果，使用基于gagasia熒光素酶酶活性接近互補(bǔ)的替代蛋白-蛋白相互作用試驗(yàn)驗(yàn)證了該結(jié)果（圖5B）。

作為一種TF，c-Jun的N端TAD結(jié)構(gòu)域在S63/S73和T91/T93殘基被c-Jun N端激酶（JNK）磷酸化激活，這被認(rèn)為促進(jìn)了其與共激活劑的相互作用。與此報(bào)道一致，使用針對S63、S73和T91的磷酸化特異性抗體的免疫印跡分析顯示，順鉑誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞中這些殘基的c-Jun持續(xù)磷酸化（圖5C）。然而，添加JNK抑制劑JNK-IN-8減少了順鉑誘導(dǎo)的c-Jun磷酸化，但不影響其與RBM39的相互作用響應(yīng)順鉑的能力（圖5D）。

作者使用一種特殊方法捕獲直接與RBP結(jié)合的RNA，結(jié)果與之前的RIP實(shí)驗(yàn)一致，觀察到內(nèi)源性RBM39向COASY pre-mRNA的募集，而在表達(dá)c-Jun的細(xì)胞中，順鉑存在時(shí)募集減少（圖5E），而在c-Jun KD細(xì)胞中未檢測到RBM39與COASY結(jié)合的減少（圖5F）。為證實(shí)這一模型，評(píng)估了c-Jun耗盡對COASY E4-5剪接的影響。在無順鉑的情況下敲除c-Jun對E4-5包含無影響（圖5G，H）。然而，下調(diào)c-Jun顯著降低了對順鉑應(yīng)答的短變異體比例，確立了c-Jun在順鉑介導(dǎo)的COASY AS中的重要性。與這些結(jié)果一致， c-Jun的缺失對細(xì)胞死亡中的細(xì)胞存活沒有影響，但顯著降低了MCF-7對順鉑的敏感性（圖5I）。總之，順鉑誘導(dǎo)的c-Jun相互作用干擾RBM39剪接活性并促進(jìn)E4-5從COASY mRNA跳躍。

圖5順鉑促進(jìn)了c-Jun和RBM39之間的聯(lián)系，并通過減少RBM39與COASY pre-mRNA的結(jié)合來控制COASYE4-5的跳躍

6、c-Jun參與全基因組順鉑誘導(dǎo)的AS，獨(dú)立于其轉(zhuǎn)錄活性

為將發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展到COASY之外，通過對c-Jun缺失的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq分析，并將其對順鉑的轉(zhuǎn)錄組反應(yīng)與對照細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組反應(yīng)進(jìn)行比較，評(píng)估c-Jun在全基因組順鉑介導(dǎo)的AS中的重要性。發(fā)現(xiàn)c-Jun缺失顯著減弱MCF-7對順鉑的轉(zhuǎn)錄組反應(yīng)。在穩(wěn)態(tài)mRNA水平上，盡管在siCtl和sic-jun處理的細(xì)胞中被順鉑差異調(diào)控的基因組在很大程度上重疊，但c-Jun敲除使順鉑調(diào)控的mRNA總數(shù)減少了約38%（圖6A）。當(dāng)檢測sic-jun處理的細(xì)胞中仍受順鉑影響的960個(gè)轉(zhuǎn)錄本時(shí)，觀察到對于其中的80%的轉(zhuǎn)錄本，在沒有c-Jun的情況下，順鉑的影響都略顯遜色（圖6B）。敲除c-Jun對順鉑誘導(dǎo)的AS有更強(qiáng)的作用（圖6C）。c-Jun在順鉑誘導(dǎo)的剪接反應(yīng)中的重要性在特異性觀察RBM39依賴與RBM39不依賴的a-SE時(shí)更為明顯（圖6D）。因?yàn)樵跊]有c-Jun的情況下，順鉑的作用更低，這些a-SE定義了一組剪接變化，這些剪接變化依賴于c-Jun介導(dǎo)的順鉑處理時(shí)RBM39的失活。通過RT-PCR驗(yàn)證了c-Jun KD對具有代表性的RBM39依賴的a-SE的抑制作用（圖6E）。

作者使用了幾種方法來評(píng)估順鉑/c-Jun/RBM39軸調(diào)控的a-SE是否優(yōu)先影響c-Jun靶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA。首先，將相應(yīng)的基因（n = 468）與分子特征數(shù)據(jù)庫（MSigDB）中的C3轉(zhuǎn)錄因子靶基因集進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)AP-1相關(guān)基因集沒有明顯的重疊。然后，建立自己的306個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的AP-1依賴基因集，定義為兩個(gè)列表TREDD和TRRUST之間的相互作用。在這些高置信度的AP-1靶點(diǎn)和468個(gè)交替拼接的基因之間只有7個(gè)基因有共同之處，這并不代表明顯的重疊（圖6F）。作者還對照已發(fā)表的順鉑處理后BT474乳腺癌細(xì)胞中c-Jun結(jié)合的209個(gè)不同啟動(dòng)子清單，發(fā)現(xiàn)沒有明顯重疊（圖6G）。最后，對公開的MCF-7中c-Jun的ChIP-seq數(shù)據(jù)集的分析顯示，在不同剪接基因的TSS周圍或a-SE周圍250bp的c-Jun峰沒有明顯富集，如COASY所示（圖6H）?？傊?，這些結(jié)果表明，c-Jun參與順鉑依賴性剪接，獨(dú)立于其轉(zhuǎn)錄功能和它在DNA上的存在。

圖6 c-Jun參與順鉑對基因表達(dá)和選擇性剪接的影響

綜上所述，本研究證實(shí)順鉑處理促進(jìn)了c-Jun和RBM39之間的相互作用，阻止了RBM39與COASYpre-mRNA內(nèi)含子4的結(jié)合，導(dǎo)致COASY-short亞型的產(chǎn)生和表達(dá)，COASY-short亞型促進(jìn)線粒體融合和細(xì)胞凋亡。

圖7 c-Jun對順鉑作用下COASY pre-mRNA剪接的調(diào)控模型

參考文獻(xiàn)：

Lemaitre Florence., Chakrama Fatima., O'Grady Tina., Peulen Olivier., Rademaker Gilles., Deward Adeline., Chabot Benoit., Piette Jacques., Colige Alain., Lambert Charles., Dequiedt Franck., Habraken Yvette.(2022). The transcription factor c-Jun inhibits RBM39 to reprogram pre-mRNA splicing during genotoxic stress. Nucleic Acids Res, undefined(undefined), undefined. doi:10.1093/nar/gkac1130