環(huán)狀RNA circTRPS1-2通過減少核糖體的產(chǎn)生抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的增殖和遷移

食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）是全球最常見的食管癌，在癌癥中發(fā)病率排名第七，死亡率排名第六。全球超過一半的ESCC病例發(fā)生在中國。盡管ESCC的治療策略取得較大進(jìn)展，但其癥狀發(fā)作較晚且具有腫瘤異質(zhì)性，這意味著大多數(shù)患者的預(yù)后較差。因此，了解疾病如何進(jìn)展并確定可靠的預(yù)后標(biāo)志物可能會(huì)改善ESCC的治療和監(jiān)測，從而改善預(yù)后。該研究發(fā)表在《Cell Death Discovery》，IF：7.109。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. circTRPS1-2在ESCC組織中的表達(dá)

對三對匹配的ESCC和相鄰正常組織進(jìn)行高通量測序，確定了2685個(gè)在癌癥中上調(diào)的circRNA和4881個(gè)下調(diào)的circRNA（圖1a, b）。用fold change≥2和P＜0.05的臨界標(biāo)準(zhǔn)，確定了5個(gè)上調(diào)的circRNA子集（hsa_circ_0006156、hsa_circ_0003764、hsa_circ_0000198、hsa_circ_0007324和hsa_circ_0016600）和41個(gè)下調(diào)circRNA的子集（圖1c）。使用一組獨(dú)立的30對ESCC和相鄰正常組織，作者驗(yàn)證了5個(gè)上調(diào)的circRNA和以下10個(gè)下調(diào)最多的circRNA（圖1d）：hsa_circ_0026782, hsa_circ_0085362（circTRPS1-2）， hsa_circ_0078299, hsa_circ_0000099, hsa_circ_0008967, hsa_circ_0001546, hsa_circ_0001882, hsa_circ_0001073, hsa_circ_0000638和hsa_circ_0000117。用引物檢測的特異性較弱的circRNA被排除。最后，作者決定關(guān)注最失調(diào)的circRNA, circTRPS1-2，進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖1通過ESCC組織高通量測序鑒定circTRPS1-2

2. circTRPS1-2在ESCC中的表達(dá)下調(diào)及亞細(xì)胞定位

根據(jù)UCSC基因組瀏覽器（GRCh37/hg19），CircTRPS1-2位于染色體8:116599227-116635985（圖2a）。該基因由TRPS1基因的第2外顯子到第5外顯子反向剪接產(chǎn)生，長度為2821 bp（圖2b）。作者發(fā)現(xiàn)，與HEECs相比，circTRPS1-2在K150和E109細(xì)胞系中均下調(diào)（圖2c）。反向剪接通過qRT-PCR產(chǎn)物的Sanger測序進(jìn)行驗(yàn)證（圖2d）。發(fā)散引物可從cDNA而非基因組DNA擴(kuò)增circTRPS1-2，而聚合引物可從cDNA和基因組DNA擴(kuò)增線性TRPS1（圖2e）。這些結(jié)果支持以下觀點(diǎn)：circTRPS1-2是通過反向剪接而不是反式剪接或基因組重排產(chǎn)生。CircTRPS1-2的環(huán)狀結(jié)構(gòu)通過其對RNAse R消化的抗性得到了證實(shí)（圖2f）。根據(jù)FISH（圖2g）和核質(zhì)分選（圖2h），CircTRPS1-2主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。

圖2circTRPS1-2在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表征和亞細(xì)胞定位

3. circTRPS1-2在ESCC中表達(dá)下調(diào)并與不良預(yù)后相關(guān)

在一組30例匹配的ESCC和相鄰正常組織中，作者發(fā)現(xiàn)circTRPS1-2在腫瘤中顯著下調(diào)（圖3a）。在BaseScope檢測中獲得了類似的結(jié)果，環(huán)狀RNA主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核（圖3b, c）。在30例患者中，circTRPS1-2表達(dá)低于中位水平的患者3年總生存率顯著低于表達(dá)高于中位水平的患者（圖3d）。circTRPS1-2可能作為腫瘤抑制因子對抗ESCC，其低表達(dá)預(yù)示不良預(yù)后。

圖3circTRPS1-2在ESCC中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)與患者預(yù)后呈正相關(guān)

4. CircTRPS1-2抑制ESCC細(xì)胞的增殖和遷移

為了研究circTRPS1-2在ESCC細(xì)胞中的生物學(xué)功能，作者在兩種ESCC細(xì)胞系中分別轉(zhuǎn)染過表達(dá)circTRPS1-2的質(zhì)粒和敲低circTRPS1-2的siRNA（圖4a）。這些轉(zhuǎn)染沒有顯著影響線性TRPS1的表達(dá)（圖4b）?；诳寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)（圖4c, d），EdU摻入實(shí)驗(yàn)（圖4e, f）和CCK-8實(shí)驗(yàn)（圖4g)，過表達(dá)circTRPS1-2顯著降低了ESCC細(xì)胞的活力和增殖能力?；趥谟希▓D4h, i）和transwell遷移（圖4j, k）的實(shí)驗(yàn)，它還顯著降低了ESCC細(xì)胞的遷移能力。敲低circTRPS1-2具有相反的作用。

圖4circTRPS1-2抑制ESCC細(xì)胞增殖和遷移

5. CircTRPS1-2抑制體內(nèi)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移

作者通過皮下或尾靜脈給小鼠注射了已感染過表達(dá)circTRPS1-2或shRNA的重組慢病毒的K150細(xì)胞，以敲低circTRPS1-2。在皮下腫瘤實(shí)驗(yàn)中（圖5a），過表達(dá)circTRPS1-2導(dǎo)致腫瘤體積（圖5b）和重量（圖5c）顯著減小。而敲低circTRPS1-2則產(chǎn)生相反的作用。在腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中，敲低circTRPS1-2顯示出顯著更多的淺表轉(zhuǎn)移（圖5d）、肺轉(zhuǎn)移（圖5e, f）和表面和深部的總體轉(zhuǎn)移（圖5g）。過表達(dá)circTRPS1-2顯示更少的肺轉(zhuǎn)移（圖5f）和總轉(zhuǎn)移（圖5g）。

圖5CircTRPS1-2在體內(nèi)抑制ESCC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移

6. CircTRPS1-2可能調(diào)控核糖體的生物發(fā)生

為了闡明circTRPS1-2在ESCC中發(fā)揮腫瘤抑制作用的通路，作者在K150細(xì)胞中免疫沉淀RNA，并使用質(zhì)譜鑒定了潛在的蛋白結(jié)合伴侶。在排除了由正義和反義RNA探針拉下的26個(gè)蛋白質(zhì)后，作者分析了與正義探針特異性結(jié)合的15個(gè)蛋白質(zhì)（圖6a）。與之前的研究不同，作者在RNA pulldown實(shí)驗(yàn)中沒有檢測到Argonaute2，這表明microRNA海綿可能不是circTRPS1-2的主要功能機(jī)制。GO和KEGG富集分析表明，這15種蛋白與核糖體和核糖體RNA在核糖體和細(xì)胞質(zhì)中的加工密切相關(guān)（圖6b, c）。作者假設(shè)circTRPS1-2可能參與核糖體的生物發(fā)生，因此作者在15個(gè)候選相互作用子中檢測了5種核糖體蛋白：S4X、S8、S24、L7和L11。作者使用RNA pulldown證實(shí)circTRPS1-2直接與這些蛋白質(zhì)結(jié)合，隨后使用蛋白質(zhì)印跡法（圖6d）；使用RNA免疫沉淀，隨后進(jìn)行qRT-PCR（圖6e）；以及使用免疫熒光染色（圖6f），將所有5種核糖體蛋白定位到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，類似于circTRPS1-2。接下來，作者用過表達(dá)或敲低circTRPS1-2的重組慢病毒感染K150細(xì)胞。根據(jù)260nm處的吸光度（圖6g），過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞提取物中核糖體水平較低，且降低到較高水平（圖6g）。電鏡觀察顯示，過表達(dá)導(dǎo)致核糖體數(shù)量和核仁減少，而敲低則相反（圖6h）。

圖6circTRPS1-2與核糖體蛋白的結(jié)合及其對核糖體生物發(fā)生的影響

結(jié)論：

該研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的circRNA，circTRPS1-2，可以通過減少核糖體的產(chǎn)生來抑制ESCC的增殖和遷移，并確立了它在ESCC治療和預(yù)后預(yù)測中的潛在用途。

參考文獻(xiàn)：

Zhao R, Chen P, Qu C, Liang J, Cheng Y, Sun Z, Tian H. Circular RNA circTRPS1-2 inhibits the proliferation and migration of esophageal squamous cell carcinoma by reducing the production of ribosomes. Cell Death Discov. 2023 Jan 12;9(1):5. doi: 10.1038/s41420-023-01300-9.