TBX2通過與CoREST復(fù)合物相互作用，作為腫瘤抑制基因的有效轉(zhuǎn)錄沉默者，以維持乳腺癌的增殖

TBX2基因位于17q23，常在乳腺腫瘤亞群中過表達。TBX2是一種抗衰老基因，通過抑制腫瘤抑制基因（TSGs），如NDRG1和CST6，促進細胞生長和存活。作者前期研究發(fā)現(xiàn)TBX2與PRC2復(fù)合體協(xié)同抑制多個TSGs，PRC2抑制恢復(fù)NDRG1表達從而抑制細胞增殖。在這里，作者現(xiàn)在確定CoREST蛋白LSD1和ZNF217是TBX2的新型互作蛋白。CoREST的遺傳或藥理學靶向模擬TBX2缺失，誘導(dǎo)NDRG1表達，并在體外和體內(nèi)消除乳腺癌生長。此外，作者發(fā)現(xiàn)TBX2/CoREST靶向NDRG1是通過Sp1招募TBX2到NDRG1啟動子上，從而導(dǎo)致NDRG1上調(diào)和癌細胞增殖減少來實現(xiàn)的。通過ChIP-seq，作者發(fā)現(xiàn)30 %的TBX2結(jié)合啟動子與ZNF217共享，并鑒定出TBX2/CoREST抑制的新靶標；在這些靶點中，lncRNA LINC00111作為細胞增殖的負調(diào)控因子?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明抑制CoREST蛋白對TBX2成癮的乳腺腫瘤是一種有前途的治療干預(yù)。本研究于2022年6月發(fā)表于《Nucleic Acids Res》，IF：19.160。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、LSD1與TBX2相互作用，是乳腺癌細胞存活所必需的

為確定TBX2是否可以形成除PRC2-like復(fù)合物以外的其他抑制復(fù)合物，作者開展下面的研究。首先，在TBX2依賴的MCF7和T47D乳腺癌模型中，使用56個已知表觀遺傳修飾的核糖核酸內(nèi)切酶siRNA（esiRNA）庫進行活性篩選；任何導(dǎo)致細胞活力降低的“hits”都可以代表TBX2潛在的功能互作蛋白（圖1A）。取4個“hits”（Hdac7、Sirtuin-3（SIRT3）、LSD1和Jumonji Domain-Containing 2B（JMJD2B）/KDM4B），對其在兩種細胞系的活力進行下游驗證。用兩個獨立的siRNA敲低每一個候選基因，48 h后的細胞活力實驗發(fā)現(xiàn)，SIRT3和LSD1對MCF7細胞活力明顯增強，但在MCF10A正常乳腺細胞中沒有（圖1B-C）。然而，在這些短期敲低中，LSD1敲低對TBX2靶標CST6的mRNA上調(diào)表現(xiàn)出最顯著和可重復(fù)的效應(yīng)，與CST6通常抑制的酶Legumain活性降低相一致（圖1D-E）。這表明LSD1可能是TBX2可能的互作伙伴。免疫共沉淀實驗證實，在MCF7和T47D模型中，TBX2和LSD1之間存在物理相互作用（圖1F）。這些數(shù)據(jù)表明TBX2可能與多種表觀遺傳調(diào)控因子相互作用，抑制LSD1可作為靶向TBX2依賴性乳腺癌的可行策略。

作者下面確定TBX2-LSD1相互作用是否存在轉(zhuǎn)錄復(fù)合體中轉(zhuǎn)錄因子與其他染色質(zhì)調(diào)控蛋白的相互作用影響蛋白的穩(wěn)定性。首先，靶向TBX2的siRNA處理MCF7細胞72h后，細胞增殖能力降低，同時伴隨著靶基因NDRG1和CST6的上調(diào)；然而，Western blot分析顯示這獨立于對LSD1蛋白水平的影響（圖2A）。同樣地，用兩個獨立的siRNA敲低LSD1，TBX2的敲低效果類似，但TBX2的RNA和蛋白沒有相應(yīng)的減少（圖2C）?？寺⌒纬蓪嶒炓沧C實，LSD1和TBX2敲低對長期生存的影響相當，克隆數(shù)顯著減少（圖2B-D）。這些現(xiàn)象在第二個細胞系（T47D）中也是一致的，敲低TBX2或LSD1導(dǎo)致類似的細胞增殖減少和NDRG1/CST6上調(diào)，而在蛋白水平上不影響彼此的穩(wěn)定性（圖2E）。結(jié)晶紫生長實驗再次證實TBX2和LSD1是T47D細胞克隆存活所必需的（圖2F）。綜合這些數(shù)據(jù)表明，雖然TBX2和LSD1對蛋白穩(wěn)定性沒有相互要求，但兩者的相互作用可能對抑制TBX2靶基因和維持乳腺癌細胞生長具有重要意義。

圖1 LSD1與TBX2相互作用。

圖2 LSD1敲低TBX2表型缺失。

2、變構(gòu)LSD1抑制劑SP-2509在體內(nèi)抑制TBX2靶點并抑制雌激素依賴的乳腺腫瘤生長

在確定LSD1是TBX2的一個新的細胞增殖所需的相互作用因子后，作者通過檢測LSD1抑制劑SP-2509、RN-1和GSK-LSD1來研究這種依賴性是否可以被藥理學靶向。首先，MCF7和T47D細胞暴露于濃度遞增的LSD1抑制劑（圖3A）。在測試的3個抑制劑中，只有SP-2509顯示出降低細胞增殖的效果，72 h時對MCF7的IC50為250 nM，對T47D的IC50為1 M。兩株細胞均對RN-1和GSK-LSD1的作用高度耐藥，在最大20 M劑量下無法達到IC50；事實上，GSKLSD1確實促進MCF7（可能是由于脫靶效應(yīng)）的生長。Western blot結(jié)果顯示，IC50劑量的SP-2509處理后，NDRG1的表達顯著上調(diào)，而20 M RN-1或20 M GSK-LSD1則無此作用。與作者之前觀察到的LSD1敲低后TBX2的表達情況類似，SP-2509干擾LSD1的活性后TBX2的蛋白水平?jīng)]有受到影響。在MCF7細胞中，NDRG1的上調(diào)與H3K4二甲基化（H3K4me2）的整體增加相關(guān)，而在T47D細胞中，NDRG1的上調(diào)與該組蛋白標記不相關(guān)，表明H3K4me2的整體變化是SP-2509處理的間接效應(yīng)（圖3B）。無論H3K4me2水平如何，用SP-2509 IC50處理兩種細胞系均導(dǎo)致靶基因NDRG1和CST6的轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)，而RN-1或GSK-LSD1在20M時幾乎沒有影響（圖3C-D）。相應(yīng)地，SP-2509處理導(dǎo)致CST6靶點Legumain的活性顯著降低（圖3E）。接下來，作者利用Tet-off誘導(dǎo)模型探討SP-2509是否可以發(fā)揮TBX2依賴的表型；該基因表達一個顯性負調(diào)控TBX2蛋白（DN-TBX2），由包含完整T結(jié)構(gòu)域的1-301個氨基酸組成，但缺少抑制結(jié)構(gòu)域所在的302-701個氨基酸。有趣的是，SP-2509的抗增殖作用在誘導(dǎo)表達截短型TBX2的MCF7細胞中更加明顯（圖3F），同時伴隨著靶標NDRG1和CST6的上調(diào)，顯著高于單獨處理組（圖3F）。值得注意的是，DN-TBX2對LSD1蛋白表達的影響可以忽略不計，這表明這種對SP-2509的敏感性增強不是由于藥物靶標的下調(diào)。為確定SP-2509是否能在體內(nèi)抑制乳腺腫瘤的生長，用MCF7細胞移植雌激素補充的小鼠，用40 mg/kg的SP-2509或溶劑處理4周（圖3G）。終點免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)，SP-2509處理的腫瘤組織中增殖標志物Ki-67的表達約為溶劑對照組的一半（圖3H）?？偟膩碚f，這些體外和體內(nèi)的數(shù)據(jù)表明，SP-2509特異性靶向LSD1的H3變構(gòu)位點，可以導(dǎo)致TSGs的有效上調(diào)，并可能是用于開發(fā)乳腺癌中的TBX2依賴性的一個可行的治療方案。

圖3 一種變構(gòu)LSD1抑制劑增強tbx2抑制基因的表達，并在體內(nèi)阻止乳腺腫瘤的生長。

3、TBX2與CoREST復(fù)合體的組件相互作用

對TBX2敲低后上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本進行ChEA富集分析，發(fā)現(xiàn)ZNF217是第二顯著的TF結(jié)合位點（圖4A）。因此，作者推測TBX2可能與ZNF217相互作用，除LSD1外，還可能與CoREST復(fù)合體的其他成員相互作用。因此，從MCF7和BT474細胞提取物中免疫沉淀ZNF217，證實了除CoREST組分LSD1和HDAC1外，還與TBX2存在物理相互作用（圖4B）。這表現(xiàn)在TBX2的下拉互作中，表現(xiàn)為與ZNF217、LSD1和HDAC1的正向互作（圖4C），重要的是，這些數(shù)據(jù)再現(xiàn)之前的發(fā)現(xiàn)，TBX2可以與HDAC1相互作用，這被證明依賴于TBX2的C端。

通過兩個獨立的ZNF217 siRNA序列處理TBX2依賴的細胞，評估ZNF217對TBX2依賴的細胞存活的重要性，這導(dǎo)致目標NDRG1和CST6的生長顯著降低和轉(zhuǎn)錄上調(diào)（圖4D）。與LSD1一樣，ZNF217敲低后NDRG1的上調(diào)與TBX2蛋白表達的變化無關(guān)，反之亦然（圖4E）。在BT474和T47D乳腺細胞系中進一步證實了這種依賴性，其中ZNF217的敲低導(dǎo)致NDRG1顯著上調(diào)并顯著降低克隆形成率（圖4F）。

為了進一步評估CoREST依賴性，通過增加抑制劑MS-275（恩替諾特）的劑量處理表達TBX2的細胞72 h，證實其對I類HDACs的敏感性，其在MCF7和T47D細胞中的IC50分別為1.5 M和0.5 M。由于多個CoREST相關(guān)蛋白的敲除可以解除對TBX2靶點的抑制，因此提出同時抑制多個復(fù)合物成員應(yīng)該導(dǎo)致明顯的表型。因此，作者發(fā)現(xiàn)低劑量的SP-2509和恩替諾特（IC50以下）對NDRG1/CST6的生長抑制和轉(zhuǎn)錄上調(diào)作用明顯大于單藥處理（圖4G）。這些結(jié)果表明，TBX2與CoREST蛋白LSD1、ZNF217和HDAC1之間的相互作用和協(xié)調(diào)活性可能是抑制TSGs促進乳腺腫瘤存活所必需的。

圖4 TBX2與CoREST抑制復(fù)合物的組分相互作用。

4、TBX2和ZNF217顯示出截然不同和重疊的全局DNA結(jié)合譜

基于作者的證據(jù)，TBX2與CoREST因子共同存在于抑制復(fù)合體中，作者進一步將作者的內(nèi)部TBX2數(shù)據(jù)與公開的MCF7進行了比較該復(fù)合物中關(guān)鍵蛋白的ChIP-seq。由于缺乏高質(zhì)量的LSD1公共數(shù)據(jù)以及作者無法通過甲醛方案實現(xiàn)LSD1富集，作者利用ZNF217 ENCODE ChIP-seq數(shù)據(jù)來代表潛在的CoREST靶向區(qū)域。作者發(fā)現(xiàn)30 %的TBX2結(jié)合位點與ZNF217峰中心重疊，這些峰的平均信號富集度在兩種蛋白中高度相似（圖5A）。與ZNF217重疊的TBX2峰主要見于啟動子區(qū)域（圖5B），激酶富集分析顯示其富集于PDGFRA下游靶基因（圖5C）。有趣的是，這些TBX2/ZNF217重疊峰對之前發(fā)現(xiàn)的CTCF和NF-Y基序缺乏富集，而對Fos/Jun（AP-1）、THAP11、GABPA和Sp1共有序列顯示顯著富集（圖5D）。相反，ZNF217信號缺失的其余TBX2位點富集在Sp1、CTCF、NF-Y和CREM基序，而AP-1、THAP11和GABPA基序沒有富集；綜上表明ZNF217影響TBX2在AP-1、THAP11和GABPA位點的定位，而ZNF217本身不經(jīng)常發(fā)生在TBX2結(jié)合的NF-Y、CTCF和CREM位點。相應(yīng)地，對TBX2信號缺失的ZNF217結(jié)合位點分析發(fā)現(xiàn)，THAP11、AP-1、GABPA和CTCF基序顯著出現(xiàn)，而NF-Y和CREM序列沒有富集（圖5D）。作者進一步檢測TBX2和ZNF217的結(jié)合位點，其中包括CoREST復(fù)合物關(guān)鍵組分RCOR1的ENCODE公共ChIP-seq數(shù)據(jù)。三個蛋白均富集的靶基因可能代表TBX2-CoREST抑制基因。雖然部分TBX2/ZNF217共享區(qū)域顯示重疊的RCOR1信號，但在ZNF217結(jié)合（圖5E）的剩余TBX2位點中沒有觀察到中心RCOR1富集。這些數(shù)據(jù)突出表明ZNF217對于RCOR1定位到TBX2靶區(qū)域是必不可少的，并且發(fā)現(xiàn)了一組TBX2可能與CoREST蛋白相互作用以實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄抑制的目標啟動子。ZNF217對TBX2-CoREST抑制的重要性也可能解釋為什么SP-2509破壞復(fù)合物中ZNF217的相互作用可以有效地去抑制TSGs和抑制乳腺癌細胞增殖。

圖5 ZNF217與乳腺癌細胞中三分之一的TBX2結(jié)合位點重疊。

5、Sp1對于TBX2介導(dǎo)的NDRG1抑制至關(guān)重要

鑒于MCF7 ChIP-seq中TBX2結(jié)合位點最富集于Sp1基序，作者推測Sp1可能與TBX2介導(dǎo)的基因抑制有關(guān)。免疫共沉淀實驗證實TBX2與Sp1存在相互作用（圖6A）。接下來，作者檢測NDRG1位點對Sp1識別位點的影響（圖6B）。與其他在電子數(shù)據(jù)庫中鑒定的TBX2/CoREST靶點相比，NDRG1位點的TBX2、ZNF217和RCOR1結(jié)合位點的排列遵循非典型模式；而在啟動子TSS處存在明顯的TBX2和RCOR1峰，該區(qū)域缺少一個較強的ZNF217峰。相反，ZNF217結(jié)合被發(fā)現(xiàn)富集在NDRG1位點3 '端內(nèi)含子區(qū)域，與RCOR1共定位。重要的是，位于內(nèi)含子10的區(qū)域被歸類為“基因內(nèi)增強子”，在GeneHancer雙精英數(shù)據(jù)庫中被編目以靶向NDRG1 TSS（圖6B）。內(nèi)含子10作為NDRG1的內(nèi)部增強子的證據(jù)被公開的MCF7數(shù)據(jù)進一步證實，表明該區(qū)域在3D實驗中與啟動子存在物理相互作用；啟動子和內(nèi)含子也被富集到組蛋白修飾H3K27Ac和組蛋白H3第4位-甲基化，活性增強子的標志。因此，NDRG1啟動子上缺乏強的ZNF217信號可以通過染色質(zhì)環(huán)化來解釋，從而影響蛋白質(zhì)從一個復(fù)合物固定到兩個明顯不同的DNA區(qū)域。有趣的是，主上皮因子GRHL2（CCNGTTNNNCNAG）的基序在NDRG1啟動子和第10內(nèi)含子的ChIP峰中心都存在（圖6B），而完全保守Sp1序列（GGGGCGGGGC）特異于TBX2峰的中心啟動子處。鑒于之前的研究發(fā)現(xiàn)GRHL2和Sp1分別是參與ZNF217和TBX2在MCF7細胞中全局結(jié)合的關(guān)鍵基序，這些觀察結(jié)果是擬合的（圖5D）。有趣的是，TBX2與GRHL2存在物理互作（圖6C）。然而，在TBX2依賴的細胞系中，單獨敲低Sp1被認為足以使NDRG1上調(diào)（圖6D），而該蛋白的丟失顯著降低了長期生存（圖6E）。匹配mRNA的分析也證實Sp1缺失后NDRG1的上調(diào)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平（圖6F）；因此，這些數(shù)據(jù)表明Sp1可能對NDRG1的抑制和維持細胞增殖有重要作用。對作者的TBX2 ChIP-seq數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)，Sp1基序主要位于TBX2峰頂100bp內(nèi)，表明這兩個因子之間存在協(xié)同或競爭的DNA結(jié)合（圖6G）。在NDRG1位點，ChIP PCR顯示Sp1敲低后TBX2與啟動子/ TSS區(qū)域的結(jié)合明顯減弱（圖6H）。作者觀察到siRNA敲低NDRG1部分挽救TBX2和ZNF217敲低的抗增殖作用（圖6I-J）。這些結(jié)果表明TBX2-CoREST復(fù)合物對NDRG1的轉(zhuǎn)錄抑制是通過Sp1招募TBX2到NDRG1啟動子上實現(xiàn)的。雖然NDRG1在TBX2/CoREST缺失后發(fā)揮抑癌作用，但其他一些靶基因（潛在的新型TSGs）可能參與了這一表型，因此需要進一步研究。

圖6 Sp1通過招募TBX2到NDRG1啟動子來抑制TSG NDRG1。

6、LINC00111被TBX2-CoREST抑制，在乳腺癌細胞中表現(xiàn)出腫瘤抑制活性

鑒于ZNF217在MCF7 ChIP-seq中占據(jù)了大量的TBX2結(jié)合位點，作者確定了這些區(qū)域中的哪些區(qū)域代表了TBX2-CoREST抑制基因，這些基因可能具有腫瘤抑制功能。在包含RCOR1的TBX2/ZNF217結(jié)合區(qū)域的子集中，作者篩選出7個啟動子，它們的轉(zhuǎn)錄本因TBX2或ZNF217功能的喪失而持續(xù)上調(diào)；其中6個基因為蛋白編碼（CELSR2、CORO2A、CTNND2、GOLT1A、KLHL20、PTK6），1個基因為長鏈非編碼RNA產(chǎn)物（LINC00111）（圖7A）。這些基因在TF結(jié)合位點內(nèi)都至少含有一個之前發(fā)現(xiàn)的顯著性基序（圖5D）。LINC00111啟動子與其他區(qū)域不同，TBX2峰含有CREM基序，在TBX2結(jié)合位點整體中較少出現(xiàn)（圖7A）。作者發(fā)現(xiàn)這7個基因都受到TBX2-CoREST的轉(zhuǎn)錄抑制，用TBX2 siRNA或ZNF217/LSD1抑制劑SP-2509處理后，相關(guān)的RNA顯著上調(diào)。LINC00111被發(fā)現(xiàn)是上調(diào)最強烈的轉(zhuǎn)錄本，其誘導(dǎo)倍數(shù)與NDRG1相當（圖7B-C）。

作者為確定TBX2-CoREST抑制靶點是否在細胞生長和存活中發(fā)揮作用，在缺乏和存在LINC00111 siRNA的情況下敲低TBX2，比較對細胞生長的影響（圖7D）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LINC00111 siRNA處理顯著挽救TBX2 siRNA以及HP1和KAP1敲低的抗增殖作用（圖7D）。有趣的是，單獨使用LINC00111 siRNA處理導(dǎo)致TBX2蛋白顯著上調(diào)，這自然與TBX2 siRNA的作用相反（圖7D，1）；這暗示LINC00111本身可能作為TBX2的阻遏物。此外，LINC00111 siRNA基底降低了促衰老因子細胞周期蛋白激酶抑制因子P21Waf1/Cip1的蛋白水平，同時阻止了TBX2 siRNA對細胞周期蛋白激酶抑制因子P21Waf1/Cip1的上調(diào)作用（圖7D，5、6）。LINC00111 siRNA不影響HP1 /KAP1的蛋白表達（圖7D，2、3）；然而，通過LINC00111 siRNA處理（圖7D，5、6），HP1/KAP1敲低對細胞周期蛋白激酶抑制因子P21Waf1/Cip1的上調(diào)作用大大降低。相反，LINC00111 siRNA不能挽救EZH2敲低的抗增殖作用，也不能導(dǎo)致細胞周期蛋白激酶抑制因子P21Waf1/Cip1的上調(diào)（圖7D，4、5、6）。這些數(shù)據(jù)表明LINC00111在與細胞周期蛋白激酶抑制因子P21Waf1/Cip1誘導(dǎo)相關(guān)的生長停滯中發(fā)揮重要作用。

為進一步證實LINC00111在生長阻滯中的作用，在MCF7和MDA-MB-361細胞中重復(fù)實驗，其中TBX2在LINC00111 siRNA存在和不存在的情況下被敲低。RT-qPCR證實TBX2缺失后LINC00111表達上調(diào)，LINC00111 siRNA干擾后LINC00111表達下調(diào)。如前所述，LINC00111敲低引起TBX2本身的上調(diào)（圖7E-F）。在這兩種細胞系中，LINC00111敲低阻止了TBX2 siRNA對細胞周期蛋白激酶抑制因子P21Waf1/Cip1的上調(diào)，并部分挽救了增殖標志物CDK1的丟失（圖7F）。在長期實驗中，LINC00111敲低也顯著降低了TBX2 siRNA對克隆形成的不利影響（圖7G）?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明LINC00111通過調(diào)節(jié)TBX2和細胞周期蛋白激酶抑制因子P21Waf1/Cip1的表達而具有腫瘤抑制特性，因此當被TBX2-CoREST復(fù)合物靶向抑制時，對癌細胞存活具有重要的影響。

圖7 LINC00111是TBX2-CoREST的轉(zhuǎn)錄抑制靶點，具有抑瘤活性。

結(jié)論

總之，作者鑒定了一個由TBX2抑癌基因形成的新的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。TBX2對其他轉(zhuǎn)錄因子的重新配置以及與多個抑制復(fù)合物的界面的適應(yīng)性使其成為一個非常強大的致癌基因。

圖8 TBX2-CoREST抑制NDRG1靶基因的機制。

參考文獻

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