PHB2通過對(duì)抗PKM2剪接維持VSMCs的收縮表型

血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的表型轉(zhuǎn)變是多種血管疾病早期的發(fā)病機(jī)制。代謝重編程可能參與VSMC表型轉(zhuǎn)變。然而，將能量代謝與不同VSMC表型聯(lián)系起來的確切分子仍然難以捉摸。我們利用基因本體注釋收集細(xì)胞能量調(diào)節(jié)基因，并對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β或血小板衍生生長(zhǎng)因子BB刺激的VSMCs進(jìn)行RNA-Seq分析。prohibitin2缺乏的VSMCs失去了可收縮的表型，這可以通過減少可收縮蛋白來證明。與Phb2^flox/flox小鼠相比，Phb2^SMCKO小鼠更容易損傷后VSMC增殖和新內(nèi)膜形成。進(jìn)一步的蛋白質(zhì)相互作用組分析、免疫共沉淀和哺乳動(dòng)物2-雜交實(shí)驗(yàn)顯示，prohibitin 2通過其C端直接與丙酮酸激酶M1/2 (PKM) mRNA拼接的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子hnRNPA1相互作用，促進(jìn)PKM2表達(dá)和糖酵解。Prohibitin2缺失促進(jìn)PKM1/2 mRNA剪接和PKM1向PKM2的逆轉(zhuǎn)，并增強(qiáng)VSMCs的糖酵解。阻斷2-hnRNPA1相互作用導(dǎo)致PKM2表達(dá)增加，糖酵解增強(qiáng)，VSMCs中收縮標(biāo)記基因表達(dá)抑制，以及體內(nèi)損傷后新內(nèi)膜形成加劇?？傊?，Prohibitin 2通過與hnRNPA1相互作用來抵消hnRNPA1介導(dǎo)的PKM選擇性剪接和葡萄糖代謝重編程來維持VSMC的收縮表型。本文于2022年10月發(fā)表于Circulation Research (IF=23.213)。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

(1) RNA序列分析預(yù)測(cè)新的將能量穩(wěn)態(tài)與VSMCs收縮表型聯(lián)系起來的候選基因

為了識(shí)別連接細(xì)胞能量代謝和VSMC表型的新候選基因，我們首先進(jìn)行了RNA-seq分析，以揭示轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β)處理增強(qiáng)收縮表型相關(guān)基因表達(dá)或血小板衍生生長(zhǎng)因子BB (PDGF-BB)處理降低收縮表型相關(guān)基因表達(dá)的原發(fā)性大鼠VSMC的轉(zhuǎn)錄組變化。在這1893個(gè)基因中，有6個(gè)基因與細(xì)胞能量調(diào)節(jié)基因數(shù)據(jù)庫(kù)重疊，包括prohibitin 2 (PHB2)、瞬時(shí)受體電位陽離子通道亞家族V成員4 (TRPV4)、ALK酪氨酸激酶受體(ALK)、組蛋白賴氨酸n-甲基轉(zhuǎn)移酶PRDM16(PRDM16)、乙酰輔酶a羧化酶2 (ACACB)和載脂蛋白C-III (APOC3)(圖1A)。接下來，我們驗(yàn)證了mRNA水平，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性大鼠VSMCs中PHB2、TRPV4和ALK的表達(dá)確實(shí)受到TGF-β和PDGF-BB的相互調(diào)節(jié)(圖1B)。接下來，我們使用靶向Phb2、Trpv4和Alk的特異性小干擾RNA (siRNAs)檢測(cè)VSMC收縮標(biāo)志物(ACT A2、CNN1和SM22α)的mRNA水平。如圖1C所示，沉默Phb2、Trpv4和Alk可導(dǎo)致VSMC收縮標(biāo)志物的表達(dá)顯著降低，提示這3個(gè)基因可能是連接VSMC能量代謝與收縮表型的候選基因。在這3個(gè)基因中，有報(bào)道稱prohibitin 2與prohibitin 1共同調(diào)控線粒體中的細(xì)胞色素-c氧化酶組裝和線粒體呼吸。然而，prohibitin 2在VSMC身份和血管穩(wěn)態(tài)中的確切作用仍然未知。另外的免疫熒光分析顯示，prohibitin2主要定位于人動(dòng)脈介質(zhì)層(圖1D)。因此，我們探討了prohibitin 2是否調(diào)控VSMC表型。

圖1：RNA序列分析預(yù)測(cè)了連接血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)能量穩(wěn)態(tài)和收縮表型的新候選基因

(2) Prohibitin2減少與VSMCs轉(zhuǎn)分化相關(guān)

進(jìn)一步的Western blotting分析顯示，在原發(fā)大鼠VSMCs中，PDGF-BB刺激后，prohibitin 2蛋白水平與VSMCs收縮標(biāo)記物同時(shí)降低(圖2A)。相反，TGF-β刺激的VSMCs表現(xiàn)出更高水平的prohibitin 2和收縮標(biāo)志物(圖2B)。血清饑餓是觸發(fā)VSMC表型從去分化狀態(tài)向分化狀態(tài)轉(zhuǎn)變的典型刺激。血清饑餓VSMCs中prohibitin 2水平升高(圖2C)。RT-qPCR分析證實(shí)，在人類VSMCs中也觀察到類似的改變(補(bǔ)充圖未展示)。值得注意的是，在VSMCs表型轉(zhuǎn)化過程中，prohibitin-1蛋白水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2A-2C)。同樣，與假手術(shù)動(dòng)脈相比，球囊損傷后3、7和14天，大鼠頸動(dòng)脈中prohibitin 2的表達(dá)顯著降低，同時(shí)VSMCs收縮標(biāo)記物減少，內(nèi)膜面積增加(圖2D)。因此，western blotting分析、RT-qPCR和免疫熒光分析表明，與對(duì)照組乳腺內(nèi)動(dòng)脈相比，頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)患者動(dòng)脈中prohibitin2的表達(dá)明顯降低(圖2E-2G)。

圖2：Prohibitin 2減少與血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)去分化相關(guān)

(3) Prohibitin 2在體外維持VSMCs的收縮表型

我們探討了prohibitin2表達(dá)的干擾是否會(huì)影響VSMC表型切換。siRNA介導(dǎo)的人VSMCsprohibitin 2沉默可導(dǎo)致收縮標(biāo)記物水平降低(補(bǔ)充圖未展示)。因此，TGF-β促進(jìn)VSMCs收縮蛋白表達(dá)的上調(diào)通過prohibitin 2沉默被取消(圖3A)。為了進(jìn)一步確定prohibitin 2在體內(nèi)VSMC表型中的確切作用，將Phb2^flox/flox小鼠與Tagln-Cre小鼠雜交，構(gòu)建VSMC特異性Phb2缺失小鼠(Phb2^SMCKO小鼠)(補(bǔ)充圖未展示)。與Phb2^flox/flox小鼠(WTVSMCs)相比，Phb2^SMCKO小鼠的原發(fā)性VSMCs (Phb2 KO VSMCs)中的VSMCs收縮標(biāo)記物的mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯降低(圖3B)。F-actin染色顯示，prohibitin 2沉默導(dǎo)致原發(fā)大鼠VSMCs從細(xì)長(zhǎng)收縮形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槎噙呅魏铣尚螒B(tài)(圖3C)。此外，經(jīng)Phb2siRNA轉(zhuǎn)染的VSMCs與經(jīng)siRNA打亂轉(zhuǎn)染的VSMCs相比，收縮能力降低，膠原凝膠收縮試驗(yàn)證明了這一點(diǎn)(siRNA打亂與siRNAPhb2: 46.3±3.86% vs 71.2±4.35%，P<0.05)(圖3D)。從Phb2^SMCKO小鼠中分離出的主動(dòng)脈環(huán)對(duì)苯腎上腺素的反應(yīng)表現(xiàn)出收縮力減弱(圖3E)。在siRNAPhb2轉(zhuǎn)染的VSMCs中，細(xì)胞遷移活性也增加了，劃傷實(shí)驗(yàn)和Boyden室實(shí)驗(yàn)證明了這一點(diǎn)(圖3F和3G)。相反，prohibitin 2過表達(dá)2可挽救PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC收縮標(biāo)記物減少和VSMC遷移(補(bǔ)充圖未展示)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明禁用2是維持VSMCs收縮表型的關(guān)鍵。

圖3：Prohibitin 2在體外維持血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的收縮表型

(4) VSMCs中Prohibitin 2的缺乏加劇體內(nèi)損傷后新生內(nèi)膜形成

對(duì)12周大的雄性Phb2^SMCKO小鼠和Phb2^flox/flox小鼠進(jìn)行頸動(dòng)脈鋼絲損傷。頸動(dòng)脈MYH11 (VSMC標(biāo)記物)和CD31 (EC標(biāo)記物)免疫染色顯示，術(shù)后第0天，Phb2^SMCKO小鼠和Phb2^flox/flox小鼠的鋼絲損傷程度相同(補(bǔ)充圖未展示)。與Phb2^flox/flox動(dòng)脈相比，鋼絲損傷后第3、5和7天，Phb2^SMCKO動(dòng)脈中VSMC收縮標(biāo)記物的表達(dá)減少，盡管新內(nèi)膜形成沒有那么明顯的誘導(dǎo)(圖4A)。相反，損傷后14天，通過BrdU染色觀察到Phb2^SMCKO動(dòng)脈細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)(圖4B)。結(jié)果，Phb2^SMCKO小鼠的新內(nèi)膜明顯大于Phb2^SMCKO小鼠(圖4C)。此外，Phb2^SMCKO動(dòng)脈新內(nèi)膜與中膜的比例遠(yuǎn)高于Phb2^flox/flox動(dòng)脈，而中膜面積和外彈性層周長(zhǎng)在兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，為了排除taglncre介導(dǎo)的Phb2敲除可能引起的胚胎發(fā)育影響，我們將Phb2floxflox小鼠與Myh11-CreERT2小鼠雜交(補(bǔ)充圖未展示)。然后，8周齡雄性Phb2^flox/flox小鼠和Phb2^flox/floxMyh11-CreERT2小鼠用他莫西芬誘導(dǎo)出生后VSMCs的抑制性2耗盡。兩組小鼠(Phb2^flox/flox+他莫西芬和Phb2^flox/floxMyh11-CreERT+他莫西芬)頸動(dòng)脈鋼絲損傷。與他莫昔芬處理的Phb2^flox/floxMyh11-CreERT2小鼠相比，他莫昔芬處理的Phb2^flox/flox/flox小鼠線損傷誘導(dǎo)的新內(nèi)膜形成顯著增加(圖4D)。因此，prohibitin 2在體內(nèi)維持VSMCs的收縮表型。

圖4：體內(nèi)血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的Prohibitin 2缺乏加劇損傷后新內(nèi)膜的形成

(5) HnRNPA1是一種新的Prohibitin2結(jié)合蛋白

我們使用原發(fā)大鼠VSMCs來探索連接prohibitin 2和VSMCs表型調(diào)制的潛在結(jié)合伙伴。3個(gè)蛋白條帶被抗prohibitin 2抗體特異性免疫沉淀，而不是對(duì)照IgG。14個(gè)被抗prohibitin 2抗體免疫沉淀而非對(duì)照IgG免疫沉淀的蛋白被鑒定為潛在的prohibitin 2結(jié)合伙伴，包括prohibitin1 (PHB1)、異質(zhì)核核糖核蛋白A1 (hnRNPA1)、顆粒蛋白(GRN)、PRMT1蛋白染色質(zhì)靶蛋白(CHTOP)、14-3-3蛋白zeta (YWHAZ)、srsf1、膜聯(lián)蛋白A2 (ANXA2)等(圖5A)。我們首先分析了prohibitin2缺乏是否會(huì)導(dǎo)致hnRNPA1表達(dá)的改變。在鋼絲損傷小鼠頸動(dòng)脈中，hnRNPA1的表達(dá)減少。因此prohibitin 2對(duì)hnRNPA1的表達(dá)沒有調(diào)控作用。接下來我們?cè)u(píng)估了prohibitin 2和hnRNPA1的潛在相互作用。在原代大鼠VSMCs的細(xì)胞裂解液中，內(nèi)源性prohibitin 2與抗hnRNPA1抗體共免疫沉淀，但不與對(duì)照IgG共免疫沉淀，反之亦然(圖5B)。進(jìn)一步的共免疫沉淀分析顯示，prohibitin 2與抗hnRNPA1抗體共免疫沉淀，但與對(duì)照IgG未在原代大鼠VSMCs的核部分共免疫沉淀，但在細(xì)胞質(zhì)部分不共免疫沉淀，這表明prohibitin 2-hnRNPA1相互作用發(fā)生在細(xì)胞核(圖5C)。hnRNPA1和prohibitin2一致地共定位于原發(fā)性大鼠VSMCs的細(xì)胞核(圖5D)。HEK293A細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染hnRNPA1 FL/ΔM9/ΔRGGbox-M9質(zhì)粒旁的pcDNA3.1-6×his-prohibitin 2質(zhì)粒和flag-CMV質(zhì)粒(圖5E)，然后使用抗flag抗體進(jìn)行共免疫沉淀分析。hnRNPA1 FL和hnRNPA1ΔM9突變體均通過標(biāo)志抗體特異性免疫沉淀出prohibitin 2，而不是對(duì)照IgG(圖5F)。hnRNPA1的RGG-box結(jié)構(gòu)域與prohibitin 2結(jié)合(圖5G)。接下來，我們亞克隆了prohibitin 2的不同結(jié)構(gòu)域(圖5H)。Flag-hnRNPA1通過抗flag抗體特異性免疫沉淀prohibitin 2的C端，但不通過對(duì)照IgG，反之亦然(圖5I)。通過哺乳動(dòng)物2-雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了prohibitin 2與hnRNPA1的C端相互作用(圖5J)?？傊ㄟ^其C端，prohibitin 2直接與hnRNPA1的RGG-box結(jié)構(gòu)域相互作用。

圖5：異質(zhì)核核糖核蛋白A1 (HnRNPA1)是一種新型的prohibitin 2結(jié)合蛋白

(6) HnRNPA1-Prohibitin 2相互作用對(duì)維持VSMC體內(nèi)外收縮表型至關(guān)重要

我們研究核內(nèi)prohibitin 2和hnRNPA1的相互作用是否對(duì)VSMC的收縮表型至關(guān)重要。將帶有C端M9結(jié)構(gòu)域的hnRNPA1的RGG-box結(jié)構(gòu)域亞克隆到腺病毒pAdT機(jī)架-CMV載體中，重組腺病毒(Ad-Flag-RGG-M9)用于阻斷hnRNPA1和prohibitin2的核相互作用。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，Ad-Flag-RGG-M9感染顯著阻斷了原發(fā)大鼠VSMCs中prohibitin 2-hnRNPA1相互作用(圖6A)。Ad-FlagRGG-M9感染抑制了α-actin和SM22α的轉(zhuǎn)錄活性，從而導(dǎo)致VSMCs去分化和細(xì)胞遷移增加(圖6B-6E)。Ad-Flag-RGG-M9感染加劇了球囊損傷后第7天VSMC收縮標(biāo)記物的減少和新內(nèi)膜形成的誘導(dǎo)(圖6F)。Ad-Flag-RGG-M9感染加重了大鼠球囊損傷模型28天新生內(nèi)膜的形成(圖6G)，而不會(huì)導(dǎo)致體重或血壓等顯著變化。免疫染色實(shí)驗(yàn)證明，與假手術(shù)Ad-GFP感染大鼠頸動(dòng)脈相比，球囊損傷Ad-GFP感染大鼠頸動(dòng)脈VSMCs中prohibitin 2水平顯著降低(補(bǔ)充圖未展示)。在Ad-Flag-RGG-M9感染的大鼠頸動(dòng)脈中，與Ad-GFP感染的大鼠頸動(dòng)脈相比，prohibitin 2的水平?jīng)]有改變，這表明prohibitin 2-hnRNPA1相互作用不可能調(diào)控prohibitin 2的表達(dá)(補(bǔ)充圖未展示)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)揭示了prohibitin 2-hnRNPA1相互作用對(duì)VSMC收縮表型維持的重要作用。

圖6：HnRNPA1-prohibitin 2相互作用對(duì)于維持血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)在體內(nèi)外的收縮表型至關(guān)重要

(7) Prohibitin 2抑制hnRNPA1介導(dǎo)的pre-PKM mRNA剪接、PKM2表達(dá)和有氧糖酵解

hnRNPA1是pre-PKM mRNA剪接的主調(diào)控因子。PKM2是PKM的首選剪接異構(gòu)體，調(diào)節(jié)糖酵解的最終限速步驟，而PKM1促進(jìn)OXPHOS。這兩種異構(gòu)體來自于PKM前mRNA的互排性選擇性剪接，反映了外顯子9 (PKM1)或外顯子10 (PKM2)的包含。hnRNPA1抑制外顯子9的序列側(cè)翼，導(dǎo)致外顯子10的包含和PKM2的表達(dá)。我們研究prohibitin 2是否影響hnRNPA1介導(dǎo)的pre-PKM mRNA剪接、PKM2的產(chǎn)生和有氧糖酵解。與Phb2^flox/flox小鼠(WTVSMCs)相比，從Phb2^SMCKO小鼠分離的原發(fā)性小鼠VSMCs (Phb2 KO VSMCs)中PKM2的mRNA水平升高，而PKM1的mRNA水平下降(補(bǔ)充圖未展示)。相比之下，pre-PKM mRNA水平?jīng)]有顯著改變，表明存在另一種剪接。PstI和NcoI酶切擴(kuò)增子后進(jìn)一步RTPCR顯示Phb2缺失促進(jìn)PKM1向PKM2的反式表達(dá)(圖7A)。在Phb2 KO原發(fā)小鼠VSMCs(圖7B)、Ad-Flag-RGG-M9感染的大鼠VSMCs(圖7C)以及感染Ad-Flag-RGG-M9的球囊損傷大鼠頸動(dòng)脈中使用western blotting也觀察到了類似的結(jié)果。Phb2 KO VSMCs糖酵解活性增強(qiáng)，OXPHOS活性降低，細(xì)胞糖酵解和有絲分裂應(yīng)激試驗(yàn)證明(圖7D)。PDGF-BB刺激的原發(fā)大鼠VSMCs中prohibitin 2被抑制的轉(zhuǎn)分化通過PKM2過表達(dá)被取消(圖7E)。為了進(jìn)一步闡明prohibitin2是否在體內(nèi)通過抑制PKM2的表達(dá)來維持VSMC的收縮表型和對(duì)抗新生內(nèi)膜的形成，我們使用帶有SM22α啟動(dòng)子的AAV9載體選擇性下調(diào)VSMC中的PKM2。在Phb2^SMCKO小鼠頸動(dòng)脈鋼絲損傷后第7天，VSMC特異性PKM2耗損挽救了VSMC收縮標(biāo)記物的減少(補(bǔ)充圖未展示)。Phb2^SMCKO小鼠鋼絲損傷后血管收縮力下降和新生內(nèi)膜形成增強(qiáng)均因VSMC特異性PKM2耗損而得到挽救(圖7F-7G)。綜上所述，prohibitin2與核hnRNPA1直接相互作用，抑制hnRNPA1介導(dǎo)的pre-PKM mRNA剪接和PKM2的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)葡萄糖代謝重編程，在體外和體內(nèi)維持VSMCs的收縮表型。

圖7：Prohibitin2抑制hnRNPA1介導(dǎo)的pre-PKM mRNA剪接、丙酮酸激酶異構(gòu)體M2 (PKM2)表達(dá)和葡萄糖代謝重編程

結(jié)論：

Prohibitin2通過直接與核hnRNPA1相互作用，抑制hnRNPA1介導(dǎo)的pre-PKM mRNA剪接、PKM2的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)葡萄糖代謝重編程(圖8)，維持VSMCs的收縮表型，抑制損傷后新內(nèi)膜的形成。Prohibitin2是維持VSMCs穩(wěn)態(tài)的內(nèi)源性糖酵解調(diào)節(jié)劑。以prohibitin2-hnRNPA1-PKM2軸為靶點(diǎn)調(diào)節(jié)VSMC能量代謝可能有助于心血管疾病的治療。

圖8：Prohibitin2在血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)表型測(cè)定的示意圖

參考文獻(xiàn)：

Jia, Y., Mao, C., Ma, Z., Huang, J., Li, W., Ma, X., Zhang, S., Li, M., Yu, F., Sun, Y., Chen, J., Feng, J., Zhou, Y., Xu, Q., Zhao, L., Fu, Y., & Kong, W. (2022). PHB2 Maintains the Contractile Phenotype of VSMCs by Counteracting PKM2 Splicing. Circulation research, 131(10), 807–824. https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.122.321005.