MYTHO，一種新的骨骼肌自噬和完整性調(diào)節(jié)劑
自噬在肌肉的質(zhì)量、功能和完整性上發(fā)揮著核心作用。調(diào)節(jié)自噬的分子機(jī)制很復(fù)雜，目前有很多未知性待挖掘。在本文中，作者鑒定一個(gè)獨(dú)立于FoxO的基因d230025d16rik，命名為MYTHO（Macroautophagyand YouTH Optimizer）。在本研究中，作者經(jīng)過(guò)一系列功能實(shí)驗(yàn)和分子研究推斷MYTHO是肌肉自噬和完整性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本研究于2023年3月發(fā)表于《Nat Commun》，IF：17.694。
技術(shù)路線(xiàn)：
1、D230025D16Rik編碼的一種蛋白MYTHO，在不同的組織中表達(dá)并在分解代謝條件下轉(zhuǎn)錄上調(diào)
為鑒定新的FoxO依賴(lài)的調(diào)節(jié)自噬的基因，作者篩選已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組圖譜，尋找在饑餓野生型（WT）小鼠骨骼肌中上調(diào)但在FoxO1/3/4肌肉特異性敲除小鼠中功能不變的轉(zhuǎn)錄本。隨后，作者通過(guò)選擇在不同物種中保守的轉(zhuǎn)錄本和具有自噬相關(guān)的LIRs/GIMs基序（LC3相互作用區(qū)和GABARAP相互作用區(qū)）的開(kāi)放閱讀框（ORF）來(lái)減少候選轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量。從上述分析中，作者鑒定D230025D16Rik基因，根據(jù)其在C. elegans中對(duì)巨噬和壽命的調(diào)控能力，將其命名為Macroautophagy andYouTH Optimizer（MYTHO）。作者通過(guò)定量RT-qPCR證實(shí)MYTHO在WT小鼠的肌肉中被誘導(dǎo)，而在FoxO1/3/4SkmKO小鼠的肌肉中不被誘導(dǎo)（圖1A）。在小鼠組織中，MYTHO蛋白在肺和肝臟中大量表達(dá)，在心臟和各種肢體肌肉中表達(dá)較少（圖1B）。值得注意的是，MYTHO蛋白表達(dá)水平在富含快收縮糖酵解纖維的肌肉（脛骨前幾和腓腸?。┖透缓湛s氧化纖維的肌肉（比目魚(yú)?。┲邢嗨疲▓D1B）。幾個(gè)萎縮條件數(shù)據(jù)集獲得的上調(diào)基因（GSE63032、GSE20103、GSE48363和GSE145480），揭示肌肉MYTHO mRNA在多種分解代謝條件下上調(diào)（圖1C）。RT-qPCR證實(shí)這一點(diǎn)（圖1D），MYTHO mRNA在饑餓、失神經(jīng)、癌癥惡病質(zhì)和敗血癥等多種自噬條件所誘導(dǎo)。
為獲得MYTHO在分解代謝條件下的病理特征，作者在抑制改變肌肉質(zhì)量和自噬的不同模型中使用各種功能損失和增益方法。MYTHO敲低（MYTHO-KD）通過(guò)電穿孔sh-RNA的質(zhì)粒來(lái)實(shí)現(xiàn)，可以防止急性饑餓和腫瘤小鼠的TA萎縮（圖1E）。MYTHO-KD在很大程度上預(yù)防14天去神經(jīng)所引發(fā)的肌纖維萎縮（圖1E）。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，腺病毒（AAV）介導(dǎo)的MYTHO-KD在3周內(nèi)顯著增加對(duì)照組小鼠的肌肉質(zhì)量，并減弱LPS誘導(dǎo)的肌肉萎縮（圖1F-H）。MYTHO-KD抑制LPS誘導(dǎo)的多種自噬蛋白和標(biāo)記物含量的增加，包括p62/SOSMT1、BNIP3和LC3-I到LC3-Ⅱ的保護(hù)，暗示MYTHO很有可能調(diào)控自噬（圖1I-J）。這些數(shù)據(jù)表明，在萎縮條件下，MYTHO增加，抑制MYTHO可以抵消急性分解代謝條件下的萎縮。
圖1 D230025D16Rik編碼一種名為MYTHO的蛋白，該蛋白在不同組織中表達(dá)，并在分解代謝條件下轉(zhuǎn)錄上調(diào)
2、MYTHO是骨骼肌自噬所需的
為明確MYTHO是否在調(diào)控骨骼肌自噬中發(fā)揮重要作用，作者測(cè)量MYTHO蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位以及自噬體的標(biāo)記（LC3B）和溶酶體（LAMP2）。作者在WT小鼠短屈肌（FDB）中電轉(zhuǎn)染編碼MYTHO-green fluorescent protein（MYTHO-GFP）和LC3BmCherry（LC3B-cherry）的質(zhì)粒，單個(gè)肌纖維進(jìn)行可視化。在分離的骨骼肌肌纖維中，MYTHO-GFP與LC3B-cherry共定位（圖2A-B），但與LAMP2共定位程度較輕（圖2A-C），證實(shí)MYTHO與自噬相關(guān)。此外，當(dāng)用營(yíng)養(yǎng)剝奪來(lái)增加體內(nèi)的自噬通量時(shí)，MYTHO在自噬體和溶酶體上的定位增強(qiáng)（圖2A-C）。為評(píng)估當(dāng)自噬體與溶酶體的融合被抑制時(shí)，MYTHO-GFP的定位是否被改變，在分離單個(gè)肌肉纖維之前，對(duì)動(dòng)物注射秋水仙素（破壞微管網(wǎng)絡(luò)）。圖2B-C展示秋水仙素處理后，MYTHO-GFP和LC3B-mCheery的共定位增加，MYTHO-GFP和LAMP2-mcherry的共定位沒(méi)有改變。饑餓增加MYTHO-GFP和自噬體和溶酶體標(biāo)志物的共定位；然而，秋水仙堿處理對(duì)MYTHO-GFP和LC3B-mCheery的共定位沒(méi)有影響，但顯著降低MYTHO-GFP在溶酶體的定位（圖2A-C）。這些結(jié)果說(shuō)明MYTHO首先定位于自噬體，然后從自噬體轉(zhuǎn)移到溶酶體。
為進(jìn)一步評(píng)估MYTHO對(duì)肌肉自噬的調(diào)節(jié)，作者研究秋水仙素處理后MYTHO-KD對(duì)自噬通量的影響。WT小鼠中含有sh-RNA寡核苷酸的MYTHO-KD在基礎(chǔ)條件下部分減少了自噬體的數(shù)量，并抑制饑餓引起的LC3B點(diǎn)狀細(xì)胞數(shù)量的增加（圖2D-E）。這些結(jié)果說(shuō)明在分解代謝條件下，MYTHO是骨骼肌自噬增強(qiáng)的重要調(diào)控子。
圖2 MYTHO是骨骼肌自噬所必需的
3、延長(zhǎng)骨骼肌中MYTHO消耗導(dǎo)致肌肉過(guò)度生長(zhǎng)、損害肌肉收縮力，并誘導(dǎo)多種嚴(yán)重的肌病特征
為進(jìn)一步探索MYTHO在控制骨骼肌質(zhì)量和功能中發(fā)揮的作用，作者測(cè)試MYTHO在不同時(shí)間點(diǎn)的影響。與之前的研究一致，AAV介導(dǎo)的MYTHO-KD在AAV介導(dǎo)后的第3周、第6周、12周和20周出現(xiàn)骨骼肌大量增加（圖3A）。為定義骨骼肌中MYTHO-KD的生理和功能影響，在AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)后的第3、6、12和20周評(píng)估TA的收縮特性。AAV感染3周后，MYTHO-KD對(duì)肌肉沒(méi)有明顯的影響（圖3B）。然而，當(dāng)AAV感染6、12和20周后，肌肉中的TA顯著低于MYTHO-KD組（圖3B）。上述數(shù)據(jù)表明長(zhǎng)時(shí)間響應(yīng)的MYTHO-KD反應(yīng)增加的肌肉量在很大程度上是無(wú)用的。
為深入了解MYTHO-KD影響肌肉收縮能力的潛在機(jī)制，作者對(duì)肌肉切片進(jìn)行組織學(xué)檢查。MYTHO-KD治療6周后發(fā)現(xiàn)一些組織異常，如不規(guī)則的藍(lán)色纖維、中心核纖維、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肌纖維壞死核小直徑再生纖維（圖3C）。接下來(lái)，作者使用EBD染料評(píng)估肌纖維膜的完整性。6周的MYTHO-KD與EBD陽(yáng)性纖維數(shù)量增加相關(guān)（圖3C-D）。另外，作者還對(duì)小鼠IgG陽(yáng)性纖維的肌肉切片進(jìn)行F4/80染色，作為細(xì)胞膜損傷的指標(biāo)。6周MYTHO-KD和12周MYTHO-KD在一定程度上增加巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)（F4/80+區(qū)域），并誘導(dǎo)IgG陽(yáng)性纖維的出現(xiàn)（圖3F）。這些數(shù)據(jù)表明延長(zhǎng)MYTHO-KD導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病特征出現(xiàn)。這些數(shù)據(jù)也突出表明MYTHO-KD引發(fā)的炎癥反應(yīng)在AAV傳導(dǎo)后6周達(dá)到高峰。
為進(jìn)一步研究MYTHO-KD對(duì)骨骼肌健康的影響，作者接下來(lái)對(duì)肌層粘連蛋白和細(xì)胞核進(jìn)行免疫染色（DAPI染色），結(jié)果顯示，12周的MYTHO-KD導(dǎo)致纖維大小異常變化，肌纖維總數(shù)增加，TA中有中央細(xì)胞核的纖維數(shù)量增加（圖3H）。作者發(fā)現(xiàn)異常纖維大小變化在12周后，MYTHO-KD患者的纖維類(lèi)型發(fā)生變化，其特征是IIB型纖維的比例增加8%，IIA型纖維的比例減少45%（圖3I）。這種由MYTHO-KD引發(fā)的纖維類(lèi)型的轉(zhuǎn)變與編碼各種肌球蛋白重鏈（MHC）亞型的基因表達(dá)的改變和幾種再生肌生成標(biāo)記的改變有關(guān)（圖3J-N）。事實(shí)上，Myog（編碼肌細(xì)胞生成素）和圍產(chǎn)期MHC異構(gòu)體（Mhy8）的表達(dá)在MYTHO-KD后的不同時(shí)間點(diǎn)顯著增加，而Myh2（一個(gè)編碼IIA型MHC的基因）在AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)后3、6、12和20周顯著下調(diào)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)MYTHO-KD延長(zhǎng)導(dǎo)致多種肌病特征。
利用電子顯微鏡對(duì)肌肉樣本的觀察，進(jìn)一步證實(shí)明顯的肌病特征是由延長(zhǎng)MYTHO-KD反應(yīng)引起的。正如圖4A所示，作者發(fā)現(xiàn)了明顯的超微結(jié)構(gòu)異常，包括肌漿網(wǎng)擴(kuò)張（SR）、板層體、線(xiàn)粒體腫脹、糖原積累、自噬物質(zhì)和管狀物質(zhì)大齡積累（圖4A）。接著，作者觀察到MYTHO-KD的肌肉中STMM1和SERCA2陽(yáng)性纖維的數(shù)量增加（圖4B-C）。如圖4D，MYTHO耗盡減少Fam134b（一個(gè)重要的ER-phagy受體）的表達(dá)。類(lèi)似于中央核疾病和和肌纖維疾病，作者觀察到有MYTHO-KD的肌肉中有desmin蛋白的積累（圖4E）。有趣的是MYTHO-KD肌肉的NADHTR染色揭示類(lèi)似于中央核病變的核樣病變（圖4F）。為評(píng)估MYTHO-KD是否改變線(xiàn)粒體酶的表達(dá)，對(duì)肌肉切片的丁二酸脫氫酶（SDH）染色結(jié)果顯示，與未表達(dá)MYTHO-KD的肌肉相比，帶有MYTHO-KD的肌肉中SDH活性染色的整體強(qiáng)度明顯降低（圖4G-H）。此外，在帶有MYTHO-KD的肌肉中檢測(cè)到一些不規(guī)則的SDH陽(yáng)性纖維（圖4G）。在saponin滲透的肌纖維中，線(xiàn)粒體Ca2+滯留能力的測(cè)量顯示出雙相變化，在MYTHO-KD六周后增加，12周后減少（圖4I）。這些表明骨骼肌的MYTHO耗竭導(dǎo)致嚴(yán)重的肌病，并伴有廣泛的超微結(jié)構(gòu)病理改變，包括管狀聚集物和大量含有非晶態(tài)物質(zhì)的液泡的存在。
圖3 骨骼肌中長(zhǎng)時(shí)間的MYTHO消耗導(dǎo)致過(guò)度生長(zhǎng)，損害肌肉收縮力，并誘發(fā)幾種嚴(yán)重的肌病特征
圖4MYTHO耗竭導(dǎo)致超結(jié)構(gòu)嚴(yán)重異常
4、MYTHO-KD觸發(fā)生長(zhǎng)信號(hào)的激活和自噬受損
為探究MYTHO-KD誘導(dǎo)的肌肉腫大和肌病特征的機(jī)制，作者對(duì)MYTHO-KD后3周和12周獲得的GAS肌肉樣本進(jìn)行微陣列分析。MYTHO-KD 12周后檢測(cè)到的前100個(gè)最穩(wěn)健的調(diào)控基因熱圖（圖5A）。長(zhǎng)時(shí)間的MYTHO-KD改變了參與骨骼肌生長(zhǎng)和發(fā)育的幾個(gè)基因的表達(dá)，如Igf2、Mustn1、Mybph和Lmcd1（圖5A）。GSEA顯示，161個(gè)基因上調(diào)，53個(gè)基因下調(diào)（Log2FC>2，p<0.05），在生長(zhǎng)因子刺激的細(xì)胞反應(yīng)、肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)育、創(chuàng)面愈合和細(xì)胞因子產(chǎn)生調(diào)控等方面均有顯著富集（圖5B，C）。RT-qPCR驗(yàn)證了12周的MYTHO-KD增強(qiáng)Igf2、金屬硫蛋白Mt1和Mt2的表達(dá)，降低Mtsn的表達(dá)（圖5D）。
考慮到MYTHO-KD引發(fā)的進(jìn)行性腫大，結(jié)合與生長(zhǎng)信號(hào)相關(guān)的基因表達(dá)增加。作者下一步通過(guò)嘌呤霉素?fù)饺敕治鰜?lái)研究MYTHO-KD是否改變體內(nèi)肌肉蛋白的合成。12周的MYTHO-KD誘導(dǎo)肌肉蛋白合成的增加（圖5E）。作者還觀察到MYTHO-KD與AKT和S6（哺乳動(dòng)物mTORC1的下游靶點(diǎn)）的磷酸化增加有關(guān)（圖5F）。這些結(jié)果表明，骨骼肌中MYTHO的缺失導(dǎo)致生長(zhǎng)信號(hào)通路的持續(xù)激活。
為評(píng)估與MYTHO-KD相關(guān)的肌肉質(zhì)量增加是否部分通過(guò)抑制蛋白質(zhì)降解介導(dǎo)，作者通過(guò)測(cè)量自噬通量來(lái)評(píng)估自噬活動(dòng)。作者發(fā)現(xiàn)12周的MYTHO-KD損傷了肌肉自噬，p62/SQSTM1和LC3BI的積累證明這一點(diǎn)，并降低LC3BⅡ/LC3BI比值（圖5G）。肌肉自噬在急性饑餓反應(yīng)中的增加，在使用MYTHO-KD的肌肉中減弱（圖5G），這表明長(zhǎng)期的MYTHO-KD會(huì)導(dǎo)致持續(xù)的自噬損傷。
圖5 MYTHO損耗激活生長(zhǎng)信號(hào)
5、自噬對(duì)于MYTHO耗竭誘發(fā)肌病表型是可有可無(wú)的
考慮到MYTHO在體內(nèi)自噬過(guò)程中起著關(guān)鍵作用（圖2），作者接下來(lái)研究與MYTHO-KD相關(guān)的肌病特征是否由于抑制自噬體形成。為驗(yàn)證其可能性，作者在肌肉特異性誘導(dǎo)Atg7敲除小鼠（Atg7iSkM-KO）的骨骼肌中引入MYTHO-KD（圖6A）。骨骼肌中Atg7缺失可阻止自噬體的形成（圖6C）。敲除MYTHO 12周后，Atg7iSkM-KO和WT小鼠的骨骼肌質(zhì)量增加到類(lèi)似程度（圖6B），這表明MYTHO的作用不僅僅是自噬調(diào)節(jié)器。骨骼肌中MYTHO和Atg7的消耗導(dǎo)致LC3BI的顯著積累，與WT小鼠相比，Atg7iSkM-KO小鼠的MYTHO-KD肌肉中LC3BI的積累更為明顯（圖6C）。重要的是，MYTHO-KD導(dǎo)致WT和Atg7iSkM-KO小鼠肌肉中心的肌核比例相似，而單獨(dú)刪除Atg7對(duì)該參數(shù)無(wú)影響（圖6D-F）。雖然電子顯微鏡證實(shí)Atg7iSkM-KO小鼠肌肉中膜結(jié)構(gòu)的積累，但這些超微結(jié)構(gòu)異常明顯，且不像MYTHO-KD小鼠肌肉中觀察到的那么嚴(yán)重（圖6G）。這些結(jié)果表明，自噬的破壞是由MYTHO控制的系統(tǒng)之一，但不是唯一的系統(tǒng)，并參與肌病表型。
圖6 自噬對(duì)于MYTHO耗竭誘發(fā)肌病表型是可有可無(wú)的
由于MYTHO-KD導(dǎo)致mTORC1通路的慢性過(guò)度激活，作者推測(cè)使用雷帕霉素治療阻斷該通路可以預(yù)防或減弱由MYTHO-KD引發(fā)的肌病表型。為驗(yàn)證猜想，作者制定了如圖7A所示的實(shí)驗(yàn)方案。MYTHO-KD在載藥處理和雷帕霉素處理小鼠的骨骼肌中均成功（圖7B-C）。正如預(yù)期的那樣，MYTHO缺陷肌肉顯示S6Ser240/244的磷酸化增加，而用雷帕霉素治療的小鼠顯示S6Ser240/244的磷酸化減少（圖7D）。MYTHO-KD增加了肌肉質(zhì)量（增加18%），然而，在雷帕霉素治療的小鼠中，MYTHO-KD的這種影響被削弱（增加9%）（圖7E）。同樣，在注射了藥物的動(dòng)物中，MYTHO-KD的破傷風(fēng)等長(zhǎng)TA比力峰值下降了約38%，而在注射了雷帕霉素的動(dòng)物中，峰值下降為13%（圖7F）。雷帕霉素處理也減弱了具有中心核的纖維比例，但對(duì)MYTHO-KD組肌纖維的總體最小Feret直徑?jīng)]有重大影響（圖7G-I）。這些數(shù)據(jù)表明，雷帕霉素抑制mTORC1在一定程度上挽救MYTHO-KD對(duì)肌肉功能和完整性的惡性影響。
圖7 雷帕霉素治療改善MYTHO-KD誘導(dǎo)的肌病。
結(jié)論
本研究確定MYTHO是一個(gè)參與自噬、骨骼肌質(zhì)量和完整性調(diào)節(jié)的新基因。MYHTO敲低能夠抑制骨骼肌的基礎(chǔ)病理和饑餓誘導(dǎo)的自噬。在各種分解代謝的條件下，包括饑餓、癌癥惡病質(zhì)、失神經(jīng)和敗血癥，MYTHO的短期缺失可以保護(hù)肌肉萎縮，但其長(zhǎng)期缺失導(dǎo)致嚴(yán)重的肌病表型，至少部分是由mTORC1通路的持續(xù)激活引起的（圖8）。MYTHO表達(dá)和功能的改變是否與人類(lèi)肌肉疾病和其他人類(lèi)疾病有關(guān)，還需要進(jìn)一步的研究。
圖8 MYTHO：一種參與調(diào)節(jié)自噬、骨骼肌質(zhì)量和完整性的新基因。
參考文獻(xiàn)
Leduc-Gaudet JP, Franco-Romero A, Cefis M, Moamer A, Broering FE, Milan G, Sartori R, Chaffer TJ, Dulac M, Marcangeli V, Mayaki D, Huck L, Shams A, MoraisJA, Duchesne E, Lochmuller H, Sandri M, Hussain SNA, Gouspillou G. (2023) MYTHO is a novel regulator of skeletal muscle autophagy and integrity. Nat Commun;14(1):1199. doi: 10.1038/s41467-023-36817-1.