胱胱硫氨酸-裂解酶(Cth)通過ERK1/2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的胞葬作用，調(diào)節(jié)腸屏障修復(fù)

腸缺血再灌注損傷(I/R)引起的炎癥反應(yīng)與危重患者的感染性并發(fā)癥和死亡率密切相關(guān)，及時有效清除凋亡細(xì)胞是降低炎癥反應(yīng)的重要組成部分。近日有研究發(fā)現(xiàn)胱胱硫氨酸-裂解酶(Cth)可激活ERK1/2信號通路，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的胞葬作用，從而促進(jìn)腸屏障修復(fù)。該研究發(fā)表在《Cell Communication and Signaling》，IF：7.525。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. I/R條件下的胞葬發(fā)生并在體外和體內(nèi)產(chǎn)生抗炎修復(fù)表型

為了闡明吞噬作用對抗炎修復(fù)表型的必要性，我們設(shè)計(jì)了巨噬細(xì)胞和凋亡內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的體外實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)組中，我們分別在缺血和缺氧環(huán)境下使用原代培養(yǎng)的小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞和THP -1細(xì)胞誘導(dǎo)的人源巨噬細(xì)胞與凋亡的IEC-6和Caco-2細(xì)胞系共培養(yǎng)(圖1)。為了確定非特異性巨噬細(xì)胞吞噬是否具有相同的效果，我們用羥化珠培養(yǎng)巨噬細(xì)胞作為對照。在與凋亡的IEC-6細(xì)胞共培養(yǎng)的小鼠源性巨噬細(xì)胞和與凋亡的Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)的人源性巨噬細(xì)胞中，吞噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬能力強(qiáng)于羥酸珠(圖1A)。此外，我們發(fā)現(xiàn)，在與凋亡的IAC -6細(xì)胞共培養(yǎng)的鼠源性巨噬細(xì)胞組和與凋亡的Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)的人源性巨噬細(xì)胞組中，修復(fù)標(biāo)志物血紅氧合酶-1 (Hmox1)和dectin-1 (Clec7a)，特異性促炎癥消退介質(zhì)(SPMs) RvD1、RvE1和LipoxinA4和抗炎因子IL-10均高于巨噬細(xì)胞和羥基化珠共培養(yǎng)組(圖1B-D)，而促炎因子CD86和TNF-α低于巨噬細(xì)胞和羥化珠共培養(yǎng)組(圖1D)。這些結(jié)果表明，胞葬對于產(chǎn)生抗炎和修復(fù)表型是必需的。

圖1在體外，吞噬凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的修復(fù)表型

在體動物模型中，I/R后腸內(nèi)是否發(fā)生胞葬尚不清楚；因此，我們使用了體內(nèi)腸胞葬檢測技術(shù)(圖2A)。我們發(fā)現(xiàn)，I/R后巨噬細(xì)胞對死亡細(xì)胞的吞噬作用逐漸增強(qiáng)(圖2C)，胞葬指數(shù)逐漸升高(圖2B)，隨著I/R后恢復(fù)時間的延長，泡騰標(biāo)志物AXL、CD36和UCP2逐漸升高(圖2D)。這些結(jié)果提示，胞葬表型不僅存在于腸道內(nèi)，而且隨著損傷修復(fù)時間的延長，胞葬表型逐漸增加。接下來，我們進(jìn)一步研究了胞葬促進(jìn)I/R腸屏障修復(fù)的機(jī)制。

圖2在體內(nèi)，受損腸管內(nèi)存在胞葬現(xiàn)象，胞葬水平隨I/R時間延長逐漸升高

I/R誘導(dǎo)的胞葬后，大量基因表達(dá)發(fā)生改變。為了更好地理解I/R后巨噬細(xì)胞的遺傳改變，我們在通過流式細(xì)胞術(shù)選擇巨噬細(xì)胞后的動物模型中進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析(圖3)。主成分分析(PCA)顯示，I/R術(shù)后12 h組與24 h、36 h和48 h組的樣本分層良好(圖3A)。然后，我們使用熱圖可視化54個基因在I/R后12 h和24 h的表達(dá)變化(圖3B)，包括28個隨著I/R時間延長而下調(diào)的基因，這些基因主要與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖標(biāo)志物Mki67和驅(qū)動蛋白家族分子Kif20a、Kif2c和Kif11相關(guān)。隨著I/R時間延長，表達(dá)上調(diào)的基因有26個，這些基因中的許多可以發(fā)揮保護(hù)作用。因此，我們重點(diǎn)研究了這些隨著I/R時間延長而上調(diào)的基因。

為了確定可以驅(qū)動巨噬細(xì)胞胞葬的差異表達(dá)基因(DEGs)，比較了I/R后12 h和36 h，以及I/R后12 h和48 h的基因表達(dá)，與熱圖分析一樣，我們在兩組比較后發(fā)現(xiàn)了許多DEGs(圖3C)。更重要的是，巨噬細(xì)胞活化的關(guān)鍵增強(qiáng)因子的Cth表達(dá)在I/R手術(shù)后顯著上調(diào)。結(jié)合PCA結(jié)果和熱圖分析，這些結(jié)果提示Cth可能是驅(qū)動I/R后巨噬細(xì)胞胞葬的關(guān)鍵基因。為了驗(yàn)證這些結(jié)果，我們使用PCR和western blotting檢測了24 h后I/R組、48 h后I/R組和假手術(shù)組的Cth表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，后I/R組的基因和蛋白表達(dá)有顯著差異，并且隨著I/R時間的增加而增加(圖3D)。這一發(fā)現(xiàn)與我們的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。因此，我們假設(shè)Cth可以改變巨噬細(xì)胞表型，支持胞葬，在腸屏障損傷修復(fù)中具有重要作用。

圖3轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)，Cth是I/R后胞葬和消退階段的潛在介質(zhì)之一

2. Cth通過ERK1/2途徑調(diào)控腸道炎癥和腸屏障損傷恢復(fù)

當(dāng)小鼠經(jīng)歷I/R損傷時，腸屏障損傷的功能指標(biāo)(I-FABP和d -乳酸)較假手術(shù)組顯著升高，而當(dāng)I/R小鼠腹腔注射Cth激動劑MCH時，有下降趨勢；相反，當(dāng)給予小鼠腹腔注射Cth抑制劑PAG時，I-FABP和d -乳酸升高(圖4A)。同樣，與假手術(shù)組相比，Cth激動劑MCH抑制了I/R損傷后促炎標(biāo)志物IL-6和TNF-α的增加，而Cth抑制劑PAG減緩了這一趨勢。此外，通過IL-10和發(fā)揮保護(hù)修復(fù)作用的RvD1、RvE1、LipoxinA4的變化，也可以驗(yàn)證Cth影響抗炎因子和修復(fù)腸道表型(圖4A)。此外，我們觀察了小鼠腸黏膜的形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)I/R后腸黏膜絨毛排列紊亂，中間有團(tuán)塊狀絨毛，損傷較假手術(shù)組嚴(yán)重。當(dāng)給予Cth抑制劑PAG時，絨毛排列更加紊亂，而給予Cth激動劑MCH時，絨毛排列略微規(guī)則(圖4B)。這些結(jié)果表明，Cth的變化影響腸道的抗炎和腸屏障損傷修復(fù)表型。

在I/R模型組給予Cth抑制劑PAG和ERK激動劑PMA腹腔注射后，d -乳酸和I-FABP以及IL-6和TNF-α的升高被逆轉(zhuǎn)，而抗炎因子IL-10和SPMs 的降低被顯著升高。在I/R模型小鼠腹腔內(nèi)給予Cth激動劑MCH和ERK抑制劑PD98059后，趨勢相反(圖4A)。同樣，腸黏膜的形態(tài)學(xué)變化也呈現(xiàn)出類似的趨勢(圖4B)。

這些處理對細(xì)胞沒有影響(圖7A)，但當(dāng)共培養(yǎng)體系中過表達(dá)Cth的巨噬細(xì)胞用PD98059處理時，促炎因子IL-10和SPMs被抑制，而加入PMA后，Cth沉默細(xì)胞中IL-10和RvD1、RvE1、LipoxinA4的表達(dá)升高(圖7B，C)。這些結(jié)果表明，Cth調(diào)節(jié)腸道炎癥，腸屏障損傷修復(fù)依賴于ERK1/2通路。

圖4體內(nèi)Cth變化影響腸屏障修復(fù)，其機(jī)制依賴于ERK1/2通路

3. Cth依賴的ERK1/2通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致胞葬增強(qiáng)

為了闡明Cth調(diào)節(jié)胞葬的潛在機(jī)制，我們首先在活鼠模型中檢測了Cth對ERK1/2通路和胞葬的影響。當(dāng)給予Cth抑制劑PAG對I/R模型進(jìn)行干預(yù)時，PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，Cth在基因水平上被顯著抑制，但對ERK1/2無影響，胞葬的生物標(biāo)志物(Axl、CD36、UCP2)也被顯著抑制(圖5B)。在蛋白水平上，當(dāng)給予Cth抑制劑時，Cth和胞葬的生物標(biāo)志物被顯著抑制，但只有ERK1/2磷酸化被抑制(圖5C, D)。腹腔注射PAG和再次給予PMA后，Cth和胞葬的生物標(biāo)志物的下降在基因和蛋白水平上被逆轉(zhuǎn)，ERK1/2唯一的變化發(fā)生在磷酸化水平(圖5B-D)。為了進(jìn)一步探討Cth、ERK1/2與巨噬細(xì)胞的關(guān)系，我們采用熒光原位雜交(FISH)三標(biāo)記共定位分析，其中Cth被染成綠色，ERK1/2被染成青色，巨噬細(xì)胞被染成紅色。很明顯，在給予Cth抑制劑PAG后，綠色(Cth)被顯著抑制，青色(ERK1/2)和紅色(功能性巨噬細(xì)胞)也被抑制，而當(dāng)給予ERK1/2激動劑PMA時，這些因子被顯著增強(qiáng)(圖5A)。

此外，當(dāng)給予I/R模型小鼠MCH時，與對照組相比，Cth和胞葬的生物標(biāo)志物的基因和蛋白表達(dá)均顯著升高。同樣，只有p-ERK1/2表達(dá)顯著增加。在已腹腔注射MCH的I/R模型小鼠中，給予PD98059后，Cth、p-ERK、Axl、CD36和UCP2最初的上升趨勢被逆轉(zhuǎn)為下降趨勢(圖5B-D)。同樣，FISH結(jié)果一致(圖5A)。在活體小鼠模型中，這些結(jié)果表明，Cth調(diào)節(jié)的巨噬細(xì)胞胞葬表型依賴于ERK1/2通路。

圖5 Cth通過ERK1 /2依賴方式誘導(dǎo)I/R后巨噬細(xì)胞胞葬

在腹膜巨噬細(xì)胞(RAW 264.7)與凋亡內(nèi)皮細(xì)胞的體外共培養(yǎng)系統(tǒng)中，對細(xì)胞的各種處理對細(xì)胞活力或凋亡均無影響(圖6A)。然而RAW 264.7的Cth過表達(dá)組與對照組相比，在基因和蛋白水平上Axl, CD36和UCP2的表達(dá)顯著增加，ERK1/2通路被激活，磷酸化水平顯著增加(圖6B, C)。這些結(jié)果表明，Cth介導(dǎo)的胞葬調(diào)節(jié)依賴于體外ERK1/2的磷酸化。

圖6在巨噬細(xì)胞中，Cth沉默或過表達(dá)導(dǎo)致下游ERK1/2的變化和體外胞葬表型

4. Cth依賴于巨噬細(xì)胞的泡騰作用來調(diào)節(jié)修復(fù)表型

在體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞松弛素D加入過表達(dá)Cth的腹腔巨噬細(xì)胞和凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞中，在排除其對細(xì)胞活力的影響后(圖7A)，發(fā)現(xiàn)原本高表達(dá)的胞葬標(biāo)志物(AXL, CD36, UCP2)顯著降低(圖7D)。高水平的IL-10和相關(guān)修復(fù)分子RvD1、RvE1和Lipoxin A4也顯著降低(圖7B、C)。這些結(jié)果表明，Cth介導(dǎo)的修復(fù)表型調(diào)節(jié)是胞葬依賴性的。

圖7在體外，Cth通過激活ERK1/2通路調(diào)節(jié)胞葬和修復(fù)表型

5. Cth、ERK1/2通路激活和胞葬均經(jīng)過臨床驗(yàn)證

在證明Cth依賴于ERK1/2通路來調(diào)節(jié)胞漿化，并在體內(nèi)外誘導(dǎo)抗炎和修復(fù)表型后，我們對臨床患者進(jìn)行采樣，以評估我們的結(jié)果的轉(zhuǎn)化相關(guān)性，并了解腸黏膜損傷和腸損傷后修復(fù)的嚴(yán)重程度。分別于術(shù)中、術(shù)后24、48 h取患者回腸造口處腸黏膜組織，并采集患者血液。隨著患者術(shù)后恢復(fù)，抗炎因子IL-10和修復(fù)相關(guān)SPMs的表達(dá)水平逐漸升高(圖8A)。此外，腸道黏膜Cth、AXL、CD36、UCP2基因及蛋白表達(dá)量隨時間逐漸升高，這與抗炎修復(fù)結(jié)果相似。并且ERK1/2通路逐漸被激活，磷酸化水平逐漸升高(圖8B, C)。具體來說，腸屏障損傷標(biāo)志物(D-LA和IFABP)以及促炎分子IL-6和TNF-α隨著時間的推移逐漸增加，這可能是患者腸道損傷和修復(fù)的結(jié)果。

圖8臨床驗(yàn)證Cth、ERK1/2、胞葬水平變化與腸道功能恢復(fù)的相關(guān)性

6. Cth與臨床患者胞葬和腸屏障修復(fù)相關(guān)

除了在臨床患者中驗(yàn)證我們的發(fā)現(xiàn)，我們還檢查了患者的腸道功能恢復(fù)結(jié)局，包括術(shù)后排氣和大便的時間，術(shù)后48小時的口服飲食不耐受，以及術(shù)后7天的感染并發(fā)癥。通過探索性觀察，我們發(fā)現(xiàn)術(shù)后48 h Cth表達(dá)與胞葬標(biāo)志物呈顯著正相關(guān)(R = 0.65, P = 0.031)，且Cth表達(dá)與抗炎分子呈正相關(guān)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)術(shù)后48 h的Cth水平與患者恢復(fù)排便的時間(R =?0.65,P = 0.03)和排便次數(shù)(R =?0.67,P = 0.023)呈顯著負(fù)相關(guān)，表明Cth高表達(dá)與患者腸道功能的恢復(fù)呈正相關(guān)。最后，我們發(fā)現(xiàn)在術(shù)后48 h口服飲食不耐受的患者和術(shù)后7 d有感染性并發(fā)癥的患者中，Cth的表達(dá)水平較低(圖8D-F)?？傮w而言，患者數(shù)據(jù)表明，Cth和胞葬與患者腸道炎癥消退和屏障恢復(fù)密切相關(guān)。

結(jié)論：

在本研究中，Cth依賴的ERK1/2通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞胞葬，進(jìn)而調(diào)節(jié)腸黏膜損傷修復(fù)(圖9)。因此，操縱胞葬促進(jìn)腸黏膜損傷修復(fù)可能是一種有效的策略。此外，本研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明影響腸黏膜損傷修復(fù)的免疫機(jī)制提供了新的線索，對促進(jìn)I/R患者的恢復(fù)具有重要意義。

圖9 Cth可以激活ERK1/2信號通路，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞胞葬，促進(jìn)腸屏障修復(fù)