MYC和MET協(xié)同驅(qū)動具有不同分子特征和脆弱性的肝細(xì)胞癌

轉(zhuǎn)錄因子MYC和受體酪氨酸激酶MET的激活增強(qiáng)是肝細(xì)胞癌(HCC)中經(jīng)常發(fā)生的事件之一。這兩個基因各自都是肝癌發(fā)生和發(fā)展的驅(qū)動因素。然而它們在HCC中的伴隨改變還未被探索。我們分析了五個獨(dú)立的人類HCC隊列的數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)了一個以預(yù)后不良為特征的高水平MYC和MET (MYC^high/MET^high)患者的子集。這一臨床觀察促使我們探索MYC和MET在體內(nèi)共存的功能，結(jié)合水動力尾靜脈注射在R26stopMet遺傳背景下的MYC表達(dá)，其中野生型MET水平在基因缺失后增強(qiáng)。結(jié)果表明，即使在沒有與慢性疾病狀態(tài)相關(guān)的預(yù)先存在的損傷的情況下，肝細(xì)胞中MYC和MET表達(dá)的增加也足以誘導(dǎo)肝臟腫瘤的發(fā)生。MET腫瘤中的異位MYC增加了Mki67增殖標(biāo)記物的表達(dá)，并將其轉(zhuǎn)化為Afp、Spp1、Gpc3、Epcam的缺失，同時Hgma1、Vim和Hep-Par1水平的升高。我們還發(fā)現(xiàn)了特異性免疫檢查點表達(dá)的開關(guān)，Ctla-4和Lag3淋巴細(xì)胞共抑制反應(yīng)增加，腫瘤細(xì)胞的Icosl共刺激反應(yīng)增加。我們提供了一些人HCC細(xì)胞系對聯(lián)合MYC和MET靶向的脆弱性的體外證據(jù)，這些細(xì)胞系對單一抑制具有抗性。機(jī)制上，MYC和MET的聯(lián)合阻塞將由MYC或MET單獨(dú)阻塞引發(fā)的部分細(xì)胞抑制作用轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性作用。這些發(fā)現(xiàn)突出了以MYChigh/METhigh為特征的HCC亞群，并記錄了MYC和MET在肝臟腫瘤發(fā)生中的功能協(xié)同作用。MYC-R26Met模型是HCC生物學(xué)、患者分類和治療的相關(guān)設(shè)置。本文于2022年11月發(fā)表于Cell Death and Disease(IF=9.685)。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

(1) HCCs亞群共表達(dá)高水平MYC和MET

在發(fā)育過程中MYC的過表達(dá)可以驅(qū)動HCC的形成，但通過水動力尾靜脈注射在C57BL6中表達(dá)MYC只會與其他致癌驅(qū)動因素聯(lián)合導(dǎo)致腫瘤。我們探討了MYC和MET的高表達(dá)水平是否在五種不同的人類HCC隊列中同時發(fā)生。LIRI-JP隊列中，236例MYC^high/MET^highHCC患者中有40例(16.9%)(圖1A)。在另外兩個獨(dú)立的HCC患者隊列中，81例患者中有13例和32個中的11個為MYC^high/MET^high(圖1A)。在TCGA隊列中發(fā)現(xiàn)了較小比例的MYC^high/MET^highHCC患者(2.7%;圖1A)。在所有HCC分析患者中，約18.8%為MYC^high/MET^high。

我們分析了MYC^high/MET^highHCC患者亞群的臨床特征。與MYC^low/MET^high相比，患者的總生存期更短(圖1B)。與MYC^low/MET^highHCC患者相比，MYC^high/MET^highHCC患者沒有分子特征、病因或突變。

圖1：MYC和MET的高表達(dá)水平在一部分HCC患者中同時發(fā)生

(2) 在小鼠肝細(xì)胞亞群中MYC和MET的同時上調(diào)引發(fā)腫瘤發(fā)生

我們評估了高M(jìn)YC和MET水平在HCC患者中同時存在是否在功能上與肝癌的發(fā)生有關(guān)。我們推斷R26stopMet基因設(shè)置中的強(qiáng)制MYC表達(dá)可能是建模該患者亞組的合適系統(tǒng)。我們進(jìn)行了流體動力尾靜脈注射兩個質(zhì)粒(a)短暫表達(dá)Cre重組酶，通過刪除一個停止盒(Cre質(zhì)粒)允許METtg表達(dá)；(b)睡美人轉(zhuǎn)座酶的瞬時表達(dá)觸發(fā)Myc轉(zhuǎn)基因基因的基因組插入(Myc質(zhì)粒;圖2A)。兩組對照組(單獨(dú)使用Cre或Myc質(zhì)粒)隨訪24周后，均未出現(xiàn)任何肉眼可見的腫瘤發(fā)生跡象(圖2B, C)。相反，11/12只MYC-R26Met小鼠(通過尾靜脈注射同時使用Cre和MYC質(zhì)粒產(chǎn)生)發(fā)生腫瘤(圖2B-D)。腫瘤重量在0.39-1.21 g之間，另外一個大腫瘤達(dá)到3.13 g(圖2E)。逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)分析證實MYC-R26Met與Alb-R26Met腫瘤相比MYC表達(dá)上調(diào)(圖2F)。在MYCR26Met和ALB-R26Met腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了相似的METtg表達(dá)水平(圖2F)。這些結(jié)果表明MYC和MET共同觸發(fā)小鼠肝臟腫瘤的發(fā)生。

圖2：在小鼠肝細(xì)胞亞群中MYC和MET的同時上調(diào)引發(fā)腫瘤發(fā)生

(3) 在MET癌模型中MYC上調(diào)改變HCC的分子特性

病理學(xué)家復(fù)查蘇木精/伊紅染色，證實腫瘤具有中分化至高分化HCC的特征，由實體或小梁狀排列的多邊形腫瘤細(xì)胞組成(圖3A)。Ki67免疫熒光染色顯示MYC-R26Met腫瘤的增殖指數(shù)明顯高于Alb-R26Met腫瘤(圖3B, C)。通過RT-qPCR分析Mki67mRNA水平證實，MYC-R26Met腫瘤的增殖率明顯高于Alb-R26Met腫瘤(圖3D)。

為了進(jìn)一步表征MYC-R26Met腫瘤，我們通過RT-qPCR分析了一系列標(biāo)記物的mRNA水平。Afp(未分化HCC的標(biāo)記物)、Spp1、Gpc3(早期HCC的標(biāo)記物)和Epcam(干性標(biāo)記物；圖3E, H)，表明MYC-R26Met腫瘤可能比Alb-R26Met腫瘤分化更大，處于更晚期。MYC-R26Met與Alb-R26Met腫瘤中與HCC特征相關(guān)的其他標(biāo)志物(Saa1, Fabp1)、祖細(xì)胞(Hnf4a, Krt19)、Wnt通路(Glul, Lgr5, Oat)、代謝(Ark1b10, Gpx2)和分化標(biāo)志物(Arg1, Ctlc, Hsp1, Yap1)的mRNA表達(dá)無任何差異(圖3H)。

我們研究了HMGA1的作用，HMGA1是一種非組蛋白染色質(zhì)相關(guān)蛋白，最近被描述為MYC陰性三陰性乳腺癌中過表達(dá)的標(biāo)記物。HMGA1是一種有效的致癌基因，可引發(fā)腫瘤進(jìn)展，并與未分化的莖樣表型和侵襲性有關(guān)。HMGA1是依賴MYC促進(jìn)莖干性和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的正反饋循環(huán)的一部分。與Alb-R26Met腫瘤相比，Hgma1在MYC-R26Met腫瘤中上調(diào)(圖3F, H)，這與最近報道的Hgma1參與MYC調(diào)控一致。

為了進(jìn)一步描述表型轉(zhuǎn)化，我們分析了描述良好的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)記的mRNA水平，并與MYC促進(jìn)實體腫瘤中EMT的能力相關(guān)。與Alb-R26Met腫瘤相比，MYC-R26Met中Vimentin(Vim)間充質(zhì)標(biāo)記物增加，E-cadherin (Cdh1)上皮標(biāo)記物減少(圖3G, H)，表明MYC-R26Met具有更多的間充質(zhì)表型，這與侵襲性、預(yù)后差和對目前臨床使用的藥物的耐藥性有關(guān)。我們進(jìn)行了免疫熒光分析，以進(jìn)一步記錄MYC-R26Met與Alb-R26Met腫瘤中發(fā)現(xiàn)的分子開關(guān)。MET在Alb-R26Met和MYC-R26Met腫瘤中均有表達(dá)，而MYC高水平僅限于MYC-R26Met腫瘤(圖4A, B)。MYC-R26Met與Alb-R26Met腫瘤相比，AFP和OPN減少，HMGA1和Hep-Par1染色增加(圖4A, B)。

最近的研究將MYC描述為不同實體癌中免疫微環(huán)境的重塑者。我們通過RT-qPCR探索MYC-R26Met腫瘤與Alb-R26Met腫瘤的免疫檢查點是否存在切換。相比于Alb-R26Met腫瘤，MYC-R26Met中Ctla4和Lag3表達(dá)更高(圖5A, B)。在MYC-R26Met和Alb-R26Met腫瘤中，Icosl mRNA水平有輕微增加，但其受體Icos無增加，這表明假定存在共刺激反應(yīng)(圖5C)。

我們研究了MET腫瘤中MYC過表達(dá)后基因表達(dá)的轉(zhuǎn)換是否發(fā)生在其他小鼠模型中，在這些模型中，HCC是由流體動力學(xué)共注射質(zhì)粒驅(qū)動MYC表達(dá)與不同已知癌基因(GSE148379)引發(fā)的。MYC與MET以外的癌基因的過表達(dá)并沒有導(dǎo)致MYC-R26Met與Alb-R26Met腫瘤中切換基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化(Afp, Spp1, Gpc3, Epcam, Mki67, Hgma1, Csp1 (Hep-Par1)，Vim，Cdh1標(biāo)記物，Ctla4, Lag3, Icosl免疫檢查點；圖5D)。這些發(fā)現(xiàn)揭示了當(dāng)MYC過表達(dá)在MET上調(diào)的情況下發(fā)生時，特定標(biāo)記物水平的有趣切換。

圖3：Myc-R26^Met和Alb-R26^Met腫瘤的肝細(xì)胞特征

圖4：Myc-R26^Met和Alb-R26^Met腫瘤的分子特征

圖5：MYC上調(diào)改變MET癌模型中HCC的免疫相關(guān)分子特性

(4) MYC和MET的組合靶向在人類HCC細(xì)胞亞群中給予反應(yīng)性

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，一組人肝癌細(xì)胞系先前已被細(xì)分為三個亞群。CL1亞群對應(yīng)于大多數(shù)分化的細(xì)胞。CL3對應(yīng)于分化較低的細(xì)胞，具有間充質(zhì)特征，以及侵襲性和干細(xì)胞樣標(biāo)記物。CL2亞群對應(yīng)于具有混合上皮-間充質(zhì)、肝特異性和干細(xì)胞樣特征的細(xì)胞。MYC和MET水平之間沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性，只有CL3亞組有不顯著的趨勢。我們選擇了CL1和CL3人類HCC細(xì)胞的一個子集來分析細(xì)胞提取物中的MYC和MET蛋白水平。細(xì)胞在MYC和MET水平上表達(dá)程度略有不同(圖6A, B)，無明顯相關(guān)性。JHH5細(xì)胞的特征是MET磷酸化和下游GAB1信號的激活，與HGF的表達(dá)一致以及自分泌MET激活(圖6A)。

我們選擇了三種人HCC細(xì)胞系(JHH5、Hep3B和Huh7)，涵蓋了一系列MYC和MET水平，以評估細(xì)胞對其靶向反應(yīng)的活力。使用10058-F4抑制MYC，其干擾MYC-MAX相互作用并阻止MYC靶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)激活。10058-F4以劑量依賴的方式降低了測試的HCC細(xì)胞的活力(圖6C)。cabozantinib是臨床用于HCC治療的一種多RTK抑制劑，它對MET的抑制僅部分干擾了我們測試的人類HCC細(xì)胞的活力(圖6C)。阻斷MYC和MET這兩種藥物的聯(lián)合使用顯著降低了我們測試的人類HCC細(xì)胞的活力(圖6C)。我們使用了另一種MYC靶向劑Omomyc，一種在癌細(xì)胞中作為阻斷MYC功能的顯性陰性劑的肽。處理72 h后，僅在Omomyc存在的人類Hep3B細(xì)胞上觀察到活性降低(圖6D)。與單一藥物相比，Omomyc和cabozantinib聯(lián)合用藥顯著降低了細(xì)胞存活率(圖6D)。生化實驗證實了10058-F4和Omomyc對MYC轉(zhuǎn)錄功能的影響，例如SURVIVIN、MYC和CYCLIND1的下調(diào)，盡管分析的細(xì)胞系之間存在差異，并且與使用的MYC阻滯劑有關(guān)(圖6E, F)。MET水平無重大變化(圖6E,F)，這與HCC細(xì)胞在聯(lián)合使用MYC阻滯劑時對cabozantinib保持敏感性一致。我們還評估了MYC和MET單獨(dú)和聯(lián)合靶向HLE和HLF細(xì)胞的效果，這些細(xì)胞被歸類為CL3亞類。細(xì)胞活力測定證實了MYC和MET聯(lián)合靶向與單一治療相比的效力(圖7A)，生化研究證實了MYC靶向后SURVIVIN、MYC和CYCLIND1的下調(diào)(圖7B)。

為了從機(jī)制上探索單一和聯(lián)合處理之間的差異，我們在Huh7細(xì)胞中使用抗磷酸化組蛋白H3和抗切割Caspase3檢測細(xì)胞增殖和凋亡。10058-F4或cabozantinib單藥治療可輕微降低HCC細(xì)胞的增殖率，而不觸發(fā)切割Caspase3的表達(dá)(圖8A, B)。相比之下，10058-F4和cabozantinib聯(lián)合治療可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(圖8A, B)。這些結(jié)果表明，MYC靶向使HCC細(xì)胞對cabozantinib易感，將部分細(xì)胞抑制作用(由單一治療觸發(fā))轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性作用(由聯(lián)合治療實現(xiàn))。

圖6：MYC靶向賦予HCC細(xì)胞系亞群對cabozantinib治療的反應(yīng)性

圖7：MYC靶向使CL3亞組的HCC細(xì)胞系對cabozantinib治療敏感

圖8：MYC和MET的聯(lián)合阻斷將輕度細(xì)胞抑制作用轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)烈細(xì)胞毒性作用

結(jié)論：

MYC阻塞通過降低MYC靶點的表達(dá)水平使HCC細(xì)胞對cabozantinib的反應(yīng)性增加，從而提供了對MET信號支持的更高程度的依賴。

參考文獻(xiàn)：

Sequera, C., Grattarola, M., Holczbauer, A., Dono, R., Pizzimenti, S., Barrera, G., Wangensteen, K. J., &Maina, F. (2022). MYC and MET cooperatively drive hepatocellular carcinoma with distinct molecular traits and vulnerabilities. Cell death & disease, 13(11), 994. https://doi.org/10.1038/s41419-022-05411-6.