METTL3通過誘導(dǎo)線粒體自噬促進(jìn)小細(xì)胞肺癌的化學(xué)耐藥性

肺癌在全球所有癌癥類型中發(fā)病率和死亡率最高，其5年總生存率較差。肺癌根據(jù)其病理特征可分為小細(xì)胞肺癌（small cell Lung cancer, SCLC）和非小細(xì)胞肺癌兩種亞型。SCLC因其侵襲性強(qiáng)、惡性程度高、易發(fā)生耐藥而導(dǎo)致眾多患者死亡。最初，大多數(shù)SCLC患者對含鉑一線化療有應(yīng)答。然而，患者的反應(yīng)往往不持久，容易產(chǎn)生化療耐藥，導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。線粒體自噬是一種選擇性自噬，參與線粒體去極化、缺氧、發(fā)育等多種生物學(xué)過程。因此，探索SCLC的耐藥機(jī)制對于尋找逆轉(zhuǎn)耐藥的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。既往研究表明，自噬參與了SCLC對化療的耐藥，且自噬在化療耐藥的SCLC細(xì)胞株中顯著增強(qiáng)。然而，關(guān)于線粒體自噬是否與SCLC耐藥特異性相關(guān)的報道較少。該研究發(fā)表于《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF: 12.658。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. METTL3在SCLC耐藥細(xì)胞株中高表達(dá)，且與患者不良預(yù)后相關(guān)

許多研究表明，m6A修飾在胃癌、肝癌等多種實(shí)體腫瘤的化療或靶向耐藥中發(fā)揮作用。為了確定m6A是否參與SCLC化療耐藥，作者對敏感和耐藥的SCLC細(xì)胞株（H69和H69AR）進(jìn)行了高通量全轉(zhuǎn)錄組測序，并分析了m6A相關(guān)基因的表達(dá)差異。作者觀察到，在化療敏感和化療耐藥細(xì)胞系之間，與m6A修飾相關(guān)的7個基因的表達(dá)有顯著差異（圖1A）。采用單因素Cox回歸分析這7個基因在兩組SCLC患者中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步分析m6A相關(guān)基因的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。隊列1來自公共數(shù)據(jù)庫GEO（GSE60052），包括79例SCLC患者的轉(zhuǎn)錄組和臨床數(shù)據(jù)，隊列2包括58例在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院接受治療的SCLC患者。在總生存（OS）的單因素Cox回歸分析中，在兩個隊列中只有METTL3與SCLC生存和預(yù)后相關(guān)（圖1B-C）。隊列1和隊列2的生存曲線均顯示，METTL3高表達(dá)與較差的OS相關(guān)，METTL3是不良預(yù)后的標(biāo)志（圖1D）。

為了進(jìn)一步明確METTL3是否在SCLC化療耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用，作者采用qRT-PCR和Western blot分析了METTL3在兩對化療藥物敏感和耐藥細(xì)胞株。METTL3在耐藥細(xì)胞株H69AR和H446DDP中的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于其對化療敏感的細(xì)胞株（圖1E-F）。免疫熒光也顯示METTL3在耐藥SCLC細(xì)胞株中高表達(dá)，主要定位于細(xì)胞核，少部分位于細(xì)胞質(zhì)（圖11G）。

圖1METTL3在SCLC中的表達(dá)及其臨床意義

2. METTL3過表達(dá)促進(jìn)SCLC化療耐藥

為了進(jìn)一步評估METTL3是否參與SCLC化療耐藥，作者使用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)建了穩(wěn)定敲低METTL3的H69AR和H446DDP細(xì)胞株。在化療后24小時檢測細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）和細(xì)胞凋亡，在耐藥細(xì)胞株中敲低METTL3顯著降低了化療藥物CDDP和VP16的IC50（圖2A-B）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也顯示，METTL3敲低組的凋亡細(xì)胞比例高于對照組，且這種差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2C-D）。Western blot結(jié)果顯示，敲低METTL3后，表明細(xì)胞凋亡強(qiáng)度的凋亡蛋白cleaved PARP和BAX的表達(dá)水平顯著升高，而抗凋亡蛋白BCL-2的表達(dá)水平顯著降低（圖2E）。

為了補(bǔ)充在化療耐藥細(xì)胞系中的發(fā)現(xiàn)，作者在化療敏感細(xì)胞系H69和H446中過表達(dá)METTL3。與空載體對照組相比，過表達(dá)METTL3的細(xì)胞化療IC50值顯著增加（圖2F-G）。凋亡蛋白的Western blot和流式細(xì)胞術(shù)分析也表明，METTL3過表達(dá)顯著降低了凋亡細(xì)胞的比例（圖2H-J）。

為了闡明METTL3誘導(dǎo)SCLC化療耐藥是否依賴于其甲基轉(zhuǎn)移酶功能，作者構(gòu)建了METTL3野生型和突變型重組質(zhì)粒（圖2K）。在SCLC細(xì)胞中過表達(dá)METTL3顯著增加了化療藥物的IC50，而敲除METTL3甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域阻斷了METTL3誘導(dǎo)的化療耐藥（圖2L）。這些數(shù)據(jù)表明，METTL3通過其甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域調(diào)控SCLC的化療耐藥過程。

圖2METTL3在體外誘導(dǎo)SCLC化療耐藥

3. METTL3在體內(nèi)促進(jìn)SCLC化療耐藥

由于鉑類-依托泊苷聯(lián)合方案仍然是SCLC的一線治療選擇，因此作者同時使用CDDP和VP16在體內(nèi)研究METTL3是否參與SCLC的化療耐藥。裸鼠皮下注射敲低METTL3的H69AR細(xì)胞或過表達(dá)METTL3的H69細(xì)胞，并給予PBS或化療藥物（CDDP 3 mg/kg和VP-16 2 mg/kg）處理。METTL3敲低顯著抑制移植腫瘤的生長（圖3A），并顯著降低化療后移植腫瘤的體積（圖3B-C）。通過IHC評估腫瘤異種移植中的METTL3表達(dá)（圖3D）。相比之下，過表達(dá)METTL3的H69腫瘤的生長速度和體積顯著高于對照H69腫瘤（圖3E-G）。METTL3在異種移植瘤中的表達(dá)也通過IHC進(jìn)行評估（圖3H）。METTL3在體內(nèi)可促進(jìn)SCLC化療耐藥，METTL3有望成為逆轉(zhuǎn)SCLC化療耐藥的有效治療靶點(diǎn)。

圖3METTL3在體內(nèi)對SCLC化療耐藥性的影響

4. METTL3促進(jìn)DCP2的m6A甲基化，調(diào)控DCP2的表達(dá)

為了進(jìn)一步闡明METTL3的靶基因以及METTL3促進(jìn)SCLC化療耐藥的機(jī)制，作者對METTL3敲低和對照H69AR細(xì)胞進(jìn)行了MeRIP-seq，敲低和對照細(xì)胞的m6A位點(diǎn)均高度富集了GGAC基序（圖4A）。由于METTL3是一種m6A甲基轉(zhuǎn)移酶，作者聚焦于敲低METTL3后m6A甲基化水平顯著降低的基因，并通過倍數(shù)差異選擇前20個基因。同時，對敲低或過表達(dá)METTL3的H446DDP和親本H446細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq檢測。然后，將MeRIP-seq基因集與RNA-seq基因經(jīng)差異分析后取P≤0.01的交集，發(fā)現(xiàn)三個基因在三個隊列之間存在顯著差異（圖4B）。為了確定METTL3的下游靶基因，作者對三個不同的交集基因進(jìn)行了熒光qPCR，發(fā)現(xiàn)DCP2是SCLC中METTL3的靶基因（圖4C-D）。來自MeRIP-seq的IGV圖也顯示，METTL3敲低后，DCP2編碼區(qū)（CDS）的m6A甲基化水平顯著降低（圖4E）。MeRIP-qPCR驗(yàn)證了上述結(jié)果。在H69AR和H446DDP細(xì)胞中，METTL3敲低導(dǎo)致DCP2 m6A甲基化水平顯著降低，在H69和H446細(xì)胞中，METTL3過表達(dá)顯著增加DCP2 m6A甲基化水平（圖4F-G）。METTL3敲低導(dǎo)致DCP2蛋白水平顯著升高，而METTL3過表達(dá)顯著降低DCP2蛋白水平（圖4H-I）。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明DCP2是METTL3的靶基因，并且METTL3通過誘導(dǎo)DCP2的m6A甲基化來下調(diào)DCP2的表達(dá)。

圖4DCP2是METTL3的下游靶點(diǎn)

5. DCP2通過調(diào)控線粒體自噬影響SCLC化療耐藥

為了確定METTL3對DCP2水平的調(diào)節(jié)是否有助于SCLC的化療耐藥性，作者分別在化療耐藥和化療敏感細(xì)胞系中構(gòu)建了DCP2過表達(dá)和DCP2敲低細(xì)胞。治療24 h后測定化療藥物CDDP和VP16的IC50。在敏感細(xì)胞中敲低DCP2顯著增加了化療藥物的IC50值（圖5A），而在耐藥細(xì)胞中過表達(dá)DCP2顯著降低了化療藥物的IC50值（圖5B）。進(jìn)一步的挽救實(shí)驗(yàn)表明，敲低METTL3后，細(xì)胞對化療藥物的敏感性增加，IC50值降低。然而，當(dāng)同時敲低METTL3和DCP2時，由METTL3引起的化療耐藥性被恢復(fù)（圖5C-D）。

為了進(jìn)一步探索METTL3介導(dǎo)化療耐藥的可能下游機(jī)制，作者對MeRIP-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了GO通路富集分析。GO分析顯示自噬相關(guān)通路高度富集，在12條差異顯著的自噬相關(guān)通路中，有5條通路屬于“線粒體自噬伴選擇性自噬”類別（圖5E）。為明確線粒體自噬是否參與SCLC化療耐藥，利用共聚焦顯微鏡評估SCLC化療敏感和耐藥細(xì)胞的線粒體自噬。在化療耐藥細(xì)胞中過表達(dá)DCP2后，Mtphagy熒光強(qiáng)度顯著降低，并且這一發(fā)現(xiàn)在分析的兩個細(xì)胞系中一致（圖5F）。在化療敏感細(xì)胞中敲低DCP2后，Mtphagy熒光強(qiáng)度顯著增加（圖5G-H）。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)在耐藥細(xì)胞系中敲低METTL3時，觀察到線粒體自噬減少，并且這種減少的線粒體自噬通過同時敲低METTL3和DCP2而恢復(fù)（圖5I-J）。綜上所述，作者發(fā)現(xiàn)METTL3的靶基因DCP2通過影響線粒體自噬水平參與SCLC的化療耐藥過程。

圖5DCP2通過調(diào)控線粒體自噬預(yù)防SCLC化療耐藥

6. DCP2調(diào)控Pink1-Parkin通路介導(dǎo)的線粒體自噬

在以往的研究中，線粒體自噬通過兩種經(jīng)典途徑發(fā)生:由膜去極化觸發(fā)的pink1-parkin介導(dǎo)的泛素依賴性途徑和受體介導(dǎo)的途徑，其核心成分包括BNIP3、BNIP3L/NIX和PHB2。為了探究DCP2是否通過這些已知的通路調(diào)控SCLC中的線粒體自噬，作者分析了DCP2敲低對化療敏感的細(xì)胞中線粒體自噬基因的表達(dá)變化。DCP2敲低導(dǎo)致Pink1和Parkin mRNA水平升高，而BNIP3、BNIP3L和PHB2的mRNA水平無顯著變化（圖6A-B）。同樣，在過表達(dá)DCP2的耐藥細(xì)胞中，Pink1和Parkin的mRNA水平降低（圖6C）。這些結(jié)果表明，DCP2影響了Pink1和Parkin的mRNA穩(wěn)定性，DCP2可以誘導(dǎo)Pink1和Parkin的降解。

為了進(jìn)一步研究SCLC細(xì)胞中線粒體自噬的變化，作者分析了Pink1, Parkin, LC3和P62的蛋白水平。在化療敏感細(xì)胞中敲低DCP2或過表達(dá)METTL3，線粒體自噬蛋白表達(dá)水平顯著升高（圖6D-E）。此外，在耐藥細(xì)胞中過表達(dá)DCP2或敲低METTL3，線粒體自噬蛋白水平降低（圖6F-G）。

進(jìn)一步的挽救實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)在耐藥細(xì)胞中同時敲低METTL3和DCP2時，敲低METTL3引起的自噬蛋白水平的變化被恢復(fù)（圖6H）。METTL3通過調(diào)控DCP2的水平，通過調(diào)控pink1-parkin介導(dǎo)的線粒體自噬參與SCLC化療耐藥。

圖6DCP2通過Pink1-Parkin通路調(diào)節(jié)線粒體自噬

7. DCP2調(diào)控SCLC線粒體損傷

大量研究證實(shí)，化療耐藥與線粒體功能障礙有關(guān)。線粒體自噬是通過自噬對線粒體的靶向吞噬和破壞，被認(rèn)為是線粒體質(zhì)量控制的主要機(jī)制。因此，作者推測SCLC化療耐藥過程中存在線粒體損傷水平的變化。線粒體膜電位（MMP）和線粒體活性氧（mtROS）是反映線粒體活性的關(guān)鍵指標(biāo)，因?yàn)樗鼈兎从沉穗娮觽鬟f和氧化磷酸化過程，而這兩個過程是生物過程和人類癌癥發(fā)病機(jī)制中ATP產(chǎn)生的驅(qū)動力。作者發(fā)現(xiàn)，在SCLC化療敏感細(xì)胞中敲低DCP2顯著減少了線粒體ROS的產(chǎn)生，并顯著增加了MMP（圖7A-B），表明敲低DCP2可以減輕化療藥物誘導(dǎo)的線粒體損傷。同樣，在化療耐藥細(xì)胞中過表達(dá)DCP2后，DCP2過表達(dá)組化療藥物誘導(dǎo)的線粒體損傷增加（mtROS熒光強(qiáng)度增加，MMP熒光強(qiáng)度降低）（圖7C-D）。進(jìn)一步的挽救實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)在耐藥細(xì)胞中同時敲低METTL3和DCP2時，METTL3引起的化療藥物誘導(dǎo)的線粒體損傷得到恢復(fù)（圖7E-F）。綜上所述，METTL3在SCLC中對DCP2的調(diào)控改變了化療藥物誘導(dǎo)的線粒體損傷水平。

圖7DCP2調(diào)節(jié)SCLC細(xì)胞線粒體損傷水平

8. METTL3抑制劑STM2457可在體內(nèi)外逆轉(zhuǎn)SCLC細(xì)胞的化療耐藥性

STM2457是一種新型、高選擇性、口服活性METTL3抑制劑，之前在一項急性白血病研究中已經(jīng)報告了STM2457。用不同濃度的STM2457處理正常肺上皮細(xì)胞（HBE），確定STM2457能夠在不影響正常肺上皮細(xì)胞增殖的情況下抑制SCLC細(xì)胞METTL3表達(dá)的合適濃度。分別用CDDP和VP16處理細(xì)胞24 h，檢測IC50和細(xì)胞凋亡。經(jīng)STM2457處理后，CDDP和VP16的IC50值顯著降低（圖8A-B）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也顯示，STM2457處理組的凋亡細(xì)胞比例高于對照組（圖8C-D）。

為觀察STM2457在體內(nèi)是否影響SCLC的耐藥性，將6.25μM STM2457處理24 h的H69AR細(xì)胞皮下注射到裸鼠體內(nèi)。與化療藥物聯(lián)用時，STM2457顯著抑制了移植瘤的生長速度，并顯著減小了化療后移植瘤的體積（圖8E-F）。綜上所述，METTL3抑制劑STM2457可以逆轉(zhuǎn)SCLC患者的化療耐藥，具有治療SCLC患者化療耐藥的潛力。

圖8METTL3抑制劑STM2457在體內(nèi)外均可逆轉(zhuǎn)SCLC細(xì)胞的化療耐藥性

結(jié)論：

該研究證實(shí)m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3通過促進(jìn)DCP2的m6A，誘導(dǎo)Pink1-Parkin通路介導(dǎo)線粒體自噬，減輕線粒體損傷，參與SCLC化療耐藥過程。同時，新型METTL3抑制劑STM2457也被證明具有調(diào)節(jié)SCLC化療耐藥的作用。因此，METTL3有望成為逆轉(zhuǎn)SCLC化療耐藥的新靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

Sun Y, Shen W, Hu S, Lyu Q, Wang Q, Wei T, Zhu W, Zhang J. METTL3 promotes chemoresistance in small cell lung cancer by inducing mitophagy. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Mar 17;42(1):65.