簡(jiǎn)單-直接-分高：SLM2以跨突觸方式塑造突觸特性

突觸特性的確定是神經(jīng)元環(huán)路功能的基礎(chǔ)?！澳┒诉x擇”轉(zhuǎn)錄因子協(xié)調(diào)協(xié)調(diào)終端基因電池可以指定細(xì)胞類型的特定屬性。此外，泛神經(jīng)元剪接調(diào)節(jié)因子被認(rèn)為與指導(dǎo)神經(jīng)元分化有關(guān)。然而，剪接調(diào)節(jié)因子如何指導(dǎo)特定的突觸特性的細(xì)胞邏輯仍然不清楚。本研究對(duì)小鼠海馬中替代剪接調(diào)節(jié)因子SLM2的細(xì)胞類型特異性功能進(jìn)行了系統(tǒng)的遺傳學(xué)分析，證明，SLM2依賴的可變剪接（AS）以跨突觸的方式專門指導(dǎo)突觸特性的規(guī)范。本文于20233年2月發(fā)表在《Cell Reports》IF: 10.0期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、SLM2的結(jié)合mRNA編碼突觸蛋白

在小鼠海馬體中，SLM2在谷氨酸能錐體細(xì)胞中表達(dá)，但也在GABAergic中間神經(jīng)元亞群中表達(dá)。其中包括定向-肺泡腔隙-分子（OLM）細(xì)胞CA1，這是一類SST陽(yáng)性的中間神經(jīng)元。在神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)，SLM2主要集中在核亞結(jié)構(gòu)中（圖1A），讓人聯(lián)想起類核小體其由SLM2同源物SAM68組成。然而，在海馬神經(jīng)元中，只有一小部分亞核結(jié)構(gòu)顯示SLM2-SAM68共定位（圖1B）。為確定SLM2相關(guān)的RNAs，在小鼠全腦和海馬樣本上使用了增強(qiáng)型交聯(lián)和免疫沉淀（eCLIP）。77%的結(jié)合事件發(fā)生在內(nèi)含子，而只有2%映射到外顯子（圖1C）。交叉連接誘導(dǎo)截?cái)辔稽c(diǎn)（CITS）分析確定了確切的蛋白質(zhì)-RNA交叉連接位點(diǎn)，這些位點(diǎn)富含UWAA元件（W=U/A；圖1D），這是SLM2在體外識(shí)別的motif。使用mCross（一種模擬RBP結(jié)合序列特異性和交聯(lián)位點(diǎn)的計(jì)算方法）進(jìn)行新的motif識(shí)別，顯示UUWAAAA 7-mer是體內(nèi)被SLM2結(jié)合的主要RNAmotif（圖1E）。使用CLIPper和IDR鑒定了復(fù)制體中的高置信度SLM2結(jié)合事件（圖1F）。對(duì)SLM2結(jié)合的mRNAs的GO分析顯示，編碼谷氨酸突觸成分的mRNAs有很強(qiáng)的富集性（圖1G）。在全腦樣本的424個(gè)高置信度的SLM2目標(biāo)mRNA中，有110個(gè)在SynGO45中被注釋為編碼突觸蛋白，其中有59個(gè)突觸前和49個(gè)突觸后成分（圖1H）。這些包括泛神經(jīng)元表達(dá)的mRNA，如Nrxn1,2,3、Nlgn1、Lrrtm4、Dlgap1,2、Tenm2和Cadm1，以及優(yōu)先在GABAergic中間神經(jīng)元表達(dá)的突觸后蛋白，如Erbb4和Gria4。在input樣本中沒(méi)有觀察到明顯的峰值，而目標(biāo)mRNA中密集的UWAAmotif簇與SLM2的結(jié)合事件緊密相連（圖1I）。這些實(shí)驗(yàn)揭示了一個(gè)編碼突觸蛋白的mRNAs陣列，它們?cè)隗w內(nèi)被內(nèi)源性的SLM2結(jié)合。

圖1結(jié)合SLM2的mRNA編碼突觸蛋白

2、細(xì)胞類型特異性SLM2依賴外顯子的鑒定

RBP的作用通常依賴于表達(dá)水平。因此，定量了海馬神經(jīng)元亞群的SLM2免疫反應(yīng)性（圖2A-B）。SLM2的表達(dá)在CA3錐體細(xì)胞（Grik4-cre）中表達(dá)量最高，在CA1錐體細(xì)胞（CamK2-cre）和SST神經(jīng)元（SST-cre）中明顯表達(dá)（圖2B）。超過(guò)90%的遺傳標(biāo)記的CA1和CA3錐體細(xì)胞表達(dá)SLM2（圖S2C）。相比之下，SLM2在齒狀顆粒細(xì)胞中不表達(dá)（圖2B）。使用RiboTrap在不同細(xì)胞類型中進(jìn)行條件性消融并繪制各自細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。分別使用CamK2-cre、Grik4-cre和SST-cre品系在海馬CA1細(xì)胞，CA3錐體細(xì)胞和SST陽(yáng)性GABAergic中間神經(jīng)元中選擇性消融SLM2，分別命名為Slm2△CamK2，Slm2△Grik4，Slm2△SST（圖2C和2D）。SLM2的免疫染色證實(shí)了該蛋白在Slm2△SST出生后第16-18天（P16-18）完全喪失，在Slm2△CamK2和Slm2△Grik4在出生后第42-45天（P42-45）75%-90%的cre陽(yáng)性細(xì)胞中完全喪失（圖2D）。

使用RiboTrap親和分離技術(shù)，對(duì)野生型和敲除型細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了深度測(cè)繪。重復(fù)樣本之間的差異很小，或者說(shuō)敲除小鼠與野生型小鼠的RiboTrap樣本之間的差異很?。▓D2E），這表明SLM2的損失并不影響這些細(xì)胞類型的終端基因電池。散點(diǎn)圖進(jìn)一步證實(shí)在整體基因表達(dá)水平上只有很小的改變(圖2F）。最強(qiáng)烈改變的轉(zhuǎn)錄物是SLM2的類似物SLM1/Khdrbs2，與功能交叉抑制相一致。

圖2 海馬細(xì)胞類型中SLM2的條件消融

SLM2的缺失并沒(méi)有廣泛地改變這些細(xì)胞類型特異性的剪接特征但改變了少量的AS事件（圖3A），包括Nrxn2選擇性剪接片段4外顯子摻入（AS4）在三個(gè)細(xì)胞群中增加（圖3A-B）。相比之下，Nrxn3的相應(yīng)替代外顯子僅在CA3（Grik4）和CA1（CamK2）細(xì)胞中被去調(diào)控（圖3C）。Syntaxin結(jié)合蛋白5-like（Stxbp5l；也叫Tomosyn-2）中相互排斥的替代外顯子e23/e24的去調(diào)控是CA1和CA3而不是Slm2△SST細(xì)胞中普遍改變的另一個(gè)剪接事件（圖3A）。整合eCLIP和RiboTrap剪接分析，發(fā)現(xiàn)在去調(diào)節(jié)的替代外顯子下游500個(gè)堿基范圍內(nèi)有密集的內(nèi)含SLM2結(jié)合事件和UWAAmotif（圖3B和3C）。這表明，SLM2的結(jié)合指導(dǎo)了上游替代外顯子的跳躍。

圖3 SLM2直接調(diào)控編碼突觸蛋白的mRNA的AS

3、SLM2缺失導(dǎo)致細(xì)胞類型特異性突觸表型

考慮到SLM2對(duì)結(jié)合和調(diào)節(jié)編碼突觸蛋白的mRNA具有顯著選擇性，所以作者探討了SLM2消融的功能后果。在突觸前CA3錐體細(xì)胞中條件消融SLM2導(dǎo)致CA1神經(jīng)元中Schaffer側(cè)支刺激引起的突觸后電流顯著增加（附圖1A-C），因此，從CA3神經(jīng)元中刪除SLM2足以改變到突觸后CA1錐體細(xì)胞的突觸傳遞。從SST中間神經(jīng)元中條理性敲除SLM2（Slm2△SST）并沒(méi)有改變SST陽(yáng)性中間神經(jīng)元的內(nèi)在特性（附圖1C-F），表明SLM2不是這些細(xì)胞的特異性所必需的。然而，eCLIP分析發(fā)現(xiàn)了大量的SLM2與編碼谷氨酸突觸蛋白的mRNA結(jié)合（圖1G-H），所以作者檢測(cè)了Slm2△SST細(xì)胞的谷氨酸能輸入。結(jié)果顯示SST中間神經(jīng)元的微小興奮性突觸后電流(mEPSC)振幅沒(méi)有變化，但觀察到mEPSC頻率顯著升高，表明Slm2△SST細(xì)胞上的谷氨酸能突觸密度增加（圖4A-E）。作者調(diào)查了對(duì)肺泡中假定的CA1軸突進(jìn)行越來(lái)越多的電刺激的AMPAR介導(dǎo)的突觸后反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)與較大的突觸數(shù)量一致的興奮明顯增加（圖4F）。此外，對(duì)同一軸突的40赫茲的刺激導(dǎo)致了短期促進(jìn)的顯著增加（圖4G）。由于該突觸的短期促進(jìn)是通過(guò)增加遞質(zhì)釋放介導(dǎo)的，這些結(jié)果表明，突觸后SST間神經(jīng)元的SLM2通過(guò)跨突觸機(jī)制控制谷氨酸傳導(dǎo)和這些細(xì)胞的突觸招募。

附圖1Slm2條件敲除細(xì)胞的電生理分析

通過(guò)光遺傳刺激SST中間神經(jīng)元和全細(xì)胞膜片鉗記錄從CA1錐體細(xì)胞來(lái)進(jìn)一步分析GABAergic SST中間神經(jīng)元的輸出突觸。發(fā)現(xiàn)Slm2△SST小鼠中光遺傳學(xué)誘發(fā)的突觸后抑制電流的大小沒(méi)有變化（圖4H）。光遺傳學(xué)誘發(fā)電流的動(dòng)力學(xué)沒(méi)有改變，表明突觸后GABA A受體的組裝正常（附圖1G）。應(yīng)用10 Hz的光遺傳刺激，在野生型細(xì)胞中誘導(dǎo)OLM-CA1突觸的抑制，使用該方案，在Slm2△SST小鼠的腦片中觀察到短期抑郁有小幅但顯著的減少（附圖1H）。因此，SST中間神經(jīng)元的SLM2選擇性缺失導(dǎo)致谷氨酸能驅(qū)動(dòng)增加到OLM中間神經(jīng)元，與輸出到CA1神經(jīng)元的突觸基本相似。

研究表明，光遺傳刺激誘導(dǎo)的OLM中間神經(jīng)元異常激活會(huì)損害物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中的物體記憶。因此，使用Slm2△SST小鼠進(jìn)行新的物體識(shí)別測(cè)試。突變型和野生型小鼠在測(cè)試場(chǎng)地的移動(dòng)能力或與物體交互的總時(shí)間方面沒(méi)有差異（圖4I）。在測(cè)試物體識(shí)別記憶時(shí)，野生型小鼠探索新物體的時(shí)間顯著增加，相比之下，Slm2△SST小鼠與新奇和熟悉的物體互動(dòng)的時(shí)間相似（圖4J-K）。因此，SST中間神經(jīng)元中SLM2的選擇性缺失與小鼠短期記憶的特定缺陷有關(guān)。

圖4 SLM2通過(guò)跨突觸的方式控制突觸的可塑性和功能

總之，本研究表明AS因子SLM2結(jié)合編碼突觸蛋白的mRNA；SLM2以細(xì)胞類型特異性的方式調(diào)節(jié)剪接異構(gòu)體；SLM2缺失導(dǎo)致突觸功能的選擇性非細(xì)胞自主改變；在SST中間神經(jīng)元中缺乏SLM2的小鼠表現(xiàn)出短期記憶缺陷。

圖形摘要

參考文獻(xiàn)：

Traunmüller L, Schulz J, Ortiz R, Feng H, Furlanis E, Gomez AM, Schreiner D, Bischofberger J, Zhang C, Scheiffele P. A cell-type-specific alternative splicing regulator shapes synapse properties in a trans-synaptic manner. Cell Rep. 2023 Feb 28;42(3):112173. doi: 10.1016/j.celrep.2023.112173. Epub ahead of print. PMID: 36862556.