7張圖揭示泛素化在癌癥中突變型p53積累和功能性獲得中的新角色

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       ?突變型p53（mutp53）蛋白通常在人類癌癥中積累到非常高的水平，以通過功能獲得（GOF）機(jī)制促進(jìn)癌癥進(jìn)展。目前，mutp53積累和GOF的潛在機(jī)制尚未完全了解。TRIM21作為mutp53的一個關(guān)鍵的E3泛素連接酶，mutp53通過篩選特定的mutp53相互作用的蛋白質(zhì)。本研究通過CO-IP和LC-MS/MS實驗確定了TRIM21直接靶向結(jié)合mutp53，且TRIM21能夠通過影響mutp53的泛素化負(fù)性調(diào)控mutp53的表達(dá)，抑制癌細(xì)胞的錨定非依賴性生長，并且能夠抑制原位和皮下瘤的生長，TRIM21的低表達(dá)了也逆轉(zhuǎn)了mutp3介導(dǎo)的癌癥的不良預(yù)后。本文章于2023年3月發(fā)表在《Journal Clinical Investigation》上，IF=15.9?

技術(shù)路線

主要研究內(nèi)容

1.TRIM21是mutp53相互作用的蛋白

       ?在表達(dá)異位熱點R175H mutp53或wtp 53的人結(jié)直腸癌p53^?/? RKO細(xì)胞中使用co-IP與p53抗體篩選特異性mutp53相互作用蛋白，然后進(jìn)行LC-MS/MS分析。TRIM21被鑒定為優(yōu)先結(jié)合R175H mutp53但不結(jié)合wtp 53的潛在蛋白質(zhì)。R175H、G245S、R248Q和R273H熱點mutp53已顯示出GOF活性并廣泛用于mutp 53 GOF研究。因此，在表達(dá)異位TRIM21-Flag和mutp53的p53^-/-RKO細(xì)胞中，使用co-IP，隨后進(jìn)行Western印跡分析，研究了TRIM21和這四個熱點GOF mutp53之間的相互作用（圖1A）。在p53^+/+ RKO細(xì)胞中沒有觀察到內(nèi)源性TRIM21和wtp53之間的明顯相互作用（圖1B），但觀察到內(nèi)源性TRIM21和不同mutp53之間的相互作用（圖1C和D）。為了確定TRIM21-mutp53相互作用所需的TRIM21結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建表達(dá)TRIM21-Flag系列缺失突變體的載體（圖1 E），并與R175H mutp53載體共轉(zhuǎn)染到p53^-/-RKO細(xì)胞中用于共IP測定。結(jié)果顯示SPRY和PRY結(jié)構(gòu)域是TRIM21與R175H mutp53相互作用的重要位點（圖1 E）。同時，R175H mutp53的DBD結(jié)構(gòu)域是R175H mutp53與TRIM21相互作用的位點（圖1F）。使用重組GST-TRIM21和His-mutp53或His-wtp53蛋白的體外谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）下拉實驗顯示，TRIM21在體外直接與mutp53相互作用，但不與wtp53相互作用（圖1H）。此外，SPRY和PRY結(jié)構(gòu)域的缺失消除了GST-TRIM21在體外與His-mutp53直接相互作用的能力（圖1H）?？傊@些結(jié)果表明TRIM21直接且特異性地與細(xì)胞中的mutp53相互作用。?

圖1：TRIM21是一種特定的mutp53結(jié)合蛋白

2.TRIM21抑制了mutp53在癌癥細(xì)胞中的積累

       ?通過對TRIM 21穩(wěn)定敲低檢測癌細(xì)胞中的mutp53蛋白水平，發(fā)現(xiàn)TRIM 21-Flag的異位表達(dá)顯著下調(diào)SK-BR3、HT29、LS1034和HCC70細(xì)胞中不同內(nèi)源mutp53蛋白的水平，而wtp53蛋白的表達(dá)水平并無明顯改變（圖2A）。此外，TRIM21-KO分別明顯增加SK-BR3和HT29細(xì)胞中R175H和R273H mutp53的蛋白質(zhì)水平（圖2B）。類似地，通過不同shRNA載體的TRIM21敲低分別明顯增加了LS1034和HCC70細(xì)胞中的G245S和R248Q mutp53蛋白水平，但對MCF 7和p53^+/+ RKO細(xì)胞中的wtp53蛋白水平影響較小（圖2C）。通過將R172H mutp53敲入小鼠，提取源自TRIM21^+/+ p53^R172H/R172H和TRIM21^-/-p53^R172H/R172H小鼠的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF），發(fā)現(xiàn)TRIM21^-/-p53^R172H/R172H MEF顯示出比TRIM21^+/+ p53^R172H/R172H MEF高得多的mutp53蛋白水平（圖2D）。然而，在TRIM21^+/+ p53^+/+和TRIM 21^-/- p53^+/+ MEF之間沒有觀察到wtp53蛋白水平的明顯差異（圖2D）。RT-qPCR測定的結(jié)果顯示，TRIM21沒有明顯影響上述細(xì)胞系中mutp53或wtp53的mRNA水平（圖2E-H）。這些結(jié)果表明，TRIM21優(yōu)先下調(diào)mutp53而不是wtp53的蛋白水平，并且TRIM21缺陷導(dǎo)致mutp53在癌細(xì)胞中積累。?

圖2：TRIM21抑制了mutp53在癌癥細(xì)胞中的表達(dá)

3.TRIM21促進(jìn)mutp53的泛素化和降解

       用表達(dá)R175H或R273H mutp53的載體連同表達(dá)WT TRIM21-Flag或缺失RING結(jié)構(gòu)域（ΔRING）的突變TRIM21-Flag的載體共轉(zhuǎn)染p53^-/-RKO細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)WT而非ΔRING TRIM21-Flag明顯下調(diào)p53^?/? RKO細(xì)胞中的外源mutp53蛋白水平，而用蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞后這種變化又被消除（圖3A和B）。為了研究TRIM21是否泛素化mutp53，在不同細(xì)胞中進(jìn)行體內(nèi)泛素化測定。WT而非ΔRING TRIM21-Flag的異位表達(dá)顯著促進(jìn)了p53^?/? RKO細(xì)胞中外源R175H和R273H mutp53的泛素化（圖3C）。此外，TRIM21 KO分別降低SK-BR3和HT29細(xì)胞中內(nèi)源性R175H和R273H mutp53的泛素化（圖3D）。TRIM 21介導(dǎo)的mutp53泛素化通過使用重組蛋白的體外泛素化測定進(jìn)一步證實; WT GST-TRIM 21誘導(dǎo)His-mutp53的泛素化，但不誘導(dǎo)Hiswtp53的泛素化，其通過TRIM21 RING結(jié)構(gòu)域的缺失而消除（圖3E）。驗證TRIM21是否使mutp53不穩(wěn)定，在內(nèi)源性R175H mutp53蛋白水平的蛋白質(zhì)印跡分析之前，用蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己酰胺（CHX）處理具有TRIM 21-Flag表達(dá)或TRIM21 KO的SK-BR3細(xì)胞及其對照細(xì)胞不同的時間段。R175H mutp53蛋白的半衰期通過TRIM21-Flag的異位表達(dá)而明顯降低（圖3F），并且通過TRIM21 KO而增加（圖3G）。這些結(jié)果表明TRIM21直接結(jié)合mutp53以泛素化和降解mutp53，并且TRIM21缺陷導(dǎo)致mutp53穩(wěn)定和積累。

圖3：TRIM21通過泛素化促進(jìn)mutp53蛋白的降解

4.TRIM21抑制mutp53積累以抑制癌細(xì)胞的錨定非依賴性生長

       ?驗證TRIM21是否影響mutp53 GOF活性，促進(jìn)錨定非依賴性細(xì)胞生長。發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞中mutp53的敲低顯著抑制了錨定非依賴性細(xì)胞生長，mutp53在癌細(xì)胞中的GOF活性（圖4A和B）。癌細(xì)胞中的TRIM21 KO顯著促進(jìn)非貼壁依賴性細(xì)胞生長，但這種效應(yīng)在很大程度上被mutp53 KO消除（圖4A和B）。異位TRIM 21-Flag表達(dá)顯著抑制細(xì)胞的貼壁非依賴性生長，但對其相應(yīng)的mutp53 KO細(xì)胞中抑制作用減弱（圖4C）。轉(zhuǎn)化的MEFs的錨定非依賴性生長被wtp53顯著抑制（p53 ^+/+ vs p53^-/-），但被R172H mutp53促進(jìn)（p53^R172H/R172H vs p53^-/-）。另外，TRIM21缺失顯著促進(jìn)p53^R172H/R172H MEFs的錨定非依賴性生長，但不促進(jìn)p53 ^+/+或p53^?/? MEFs的錨定非依賴性生長（圖4D）。這些結(jié)果共同表明，TRIM21通過抑制mutp53積累和GOF來抑制貼壁非依賴性細(xì)胞生長。?

圖4：TRIM21抑制mutp53 GOF，促進(jìn)癌細(xì)胞的非錨定生長

5.TRIM21抑制mutp53積累以抑制原位和皮下腫瘤的生長

      ? 通過SKBR3細(xì)胞構(gòu)建的原位乳腺腫瘤和在無胸腺裸鼠中皮下注射HT29細(xì)胞形成的結(jié)腸直腸異種移植腫瘤，SK-BR3細(xì)胞中的TRIM21 KO顯著促進(jìn)SK-BR3原位腫瘤的生長，而R175H mutp53 KO顯著抑制腫瘤生長并在很大程度上消除了TRIM21 KO對腫瘤生長的促進(jìn)作用（圖5A）。SK-BR3腫瘤組織的蛋白質(zhì)印跡分析和IHC染色顯示TRIM21 KO明顯增強(qiáng)mutp53蛋白水平（圖5B和C）。同樣，HT29細(xì)胞中的TRIM21 KO顯著促進(jìn)腫瘤生長并明顯增加腫瘤中mutp53蛋白水平，但HT29細(xì)胞中的mutp53 KO顯著抑制腫瘤生長并在很大程度上消除了TRIM21 KO對腫瘤生長的促進(jìn)作用（圖5D和E）。另外，TRIM21-Flag表達(dá)大大降低了SK-BR3和HT29腫瘤中的mutp53水平（圖5G和I）。這些結(jié)果共同證明了TRIM21抑制mutp53積累以抑制mutp53 G0F促進(jìn)腫瘤生長。?

圖5：TRIM21抑制mutp53積累促進(jìn)腫瘤生長

6.TRIM21的低表達(dá)校正mutp53癌癥中的不良預(yù)后

       組織芯片的結(jié)果顯示，TRIM21的表達(dá)在兩個不同的結(jié)腸直腸癌組中，分別有63%（n=57/90）和44%（n=22/50）的結(jié)腸直腸癌下調(diào)（圖6A），在50%（n=20/40）的乳腺癌中下調(diào)（圖6 B）。此外，與其匹配的相鄰非腫瘤組織相比，結(jié)直腸癌和乳腺癌中TRIM21的平均蛋白水平顯著降低（圖6A和B）。同樣，與非腫瘤乳腺組織相比，TRIM21蛋白水平在這些乳腺癌中顯著下調(diào)（圖6C）。TCGA數(shù)據(jù)庫中的TRIM21表達(dá)的分析顯示，幾種類型的腫瘤中的低TRIM21表達(dá)與患有mutp53癌癥而非wtp53癌癥的患者中的不良臨床結(jié)果顯著相關(guān)（圖6D）。這些結(jié)果表明TRIM21在一些攜帶mutp53的癌癥中的腫瘤抑制功能。

圖6：TRIM21的低表達(dá)校正mutp53癌癥中的不良預(yù)后

7.TRIM21缺失導(dǎo)致mutp53在正常組織中積累并促進(jìn)p53^R172H/R172H小鼠的腫瘤發(fā)生

       ?構(gòu)建TRIM21^+/+ p53^R172H/R172H和TRIM21^-/-p53^R172H/R172H小鼠，發(fā)現(xiàn)TRIM21缺失沒有明顯影響p53^-/-或p53^+/+小鼠的壽命，但TRIM21缺失導(dǎo)致腫瘤發(fā)病更早，這顯著降低了p53^R172H/R172H小鼠的壽命。TRIM21^+/+ p53^R172H/R172H和TRIM21^-/-p53 ^R172H/R172H小鼠的中位生存期分別為157天和134天（p=0.0002；圖7A）。在p53 ^{R172 H/R172H}小鼠的正常組織（包括脾、胸腺、小腸和結(jié)腸組織）中未觀察到mutp53蓄積，通過Western印跡和IHC分析，在TRIM21^-/-p53^R172H/R172H小鼠的這些正常組織中mutp53蛋白蓄積至高水平（圖7B和C）。而在正常（非應(yīng)激）條件下，wtp53蛋白水平在正常組織中保持在非常低的水平（圖7D）。盡管mutp53在TRIM21^+/+ p53^R172H/R172H和TRIM21^-/-p53^R172H/R172H小鼠的腫瘤中積累，但與TRIM 21^+/+ p53^R172H/R172H腫瘤相比，在TRIM21^-/-p53^R172H/R172H腫瘤中觀察到更高水平的mutp53積累（圖7 E）。通過co-IP測定證實了腫瘤中TRIM21和R172H mutp53蛋白之間的相互作用，表明TRIM21與mutp53在體內(nèi)相互作用（圖7 F）?？傊?，這些結(jié)果表明TRIM 21缺失導(dǎo)致mutp53在正常組織中積累，并且mutp53在腫瘤中進(jìn)一步積累，導(dǎo)致p53^R172H/R172H小鼠的更早的腫瘤發(fā)作和壽命縮短。?

圖7：TRIM21缺失導(dǎo)致mutp53積累并促進(jìn)p53^R172H/R172H小鼠的腫瘤發(fā)生

結(jié)論
       ?總之，這個研究揭示了癌癥中mutp53積累和GOF的關(guān)鍵機(jī)制，并且還鑒定了TRIM21在癌癥中的腫瘤抑制功能的重要機(jī)制。更好地理解腫瘤中mutp53積累和GOF的機(jī)制將為開發(fā)針對攜帶mutp53的癌癥的有效治療策略提供新的機(jī)會。
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實驗方法
細(xì)胞培養(yǎng)和載體構(gòu)建，CRISPR/Cas9構(gòu)建 KO細(xì)胞系，LC-MS/MS測定，western blot，免疫共沉淀實驗，GST pull-down，RT-qPCR，泛素化測定，半衰期分析，錨定非依賴性生長測定，小鼠成瘤實驗，免疫組化，TCGA數(shù)據(jù)庫分析。
參考文獻(xiàn)：
Liu, J., Zhang, C., Xu, D., Zhang, T., Chang, C. Y., Wang, J., Liu, J., Zhang, L., Haffty, B. G., Zong, W. X., Hu, W., & Feng, Z. (2023). The ubiquitin ligase TRIM21 regulates mutant p53 accumulation and gain of function in cancer. The Journal of clinical investigation, 133(6), e164354. https://doi.org/10.1172/JCI164354

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