circSLC4A7-胃癌的新靶點(diǎn)

       胃癌干細(xì)胞(GCSCs)在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。 circRNAs參與多種癌癥生物學(xué)過(guò)程，并作為腫瘤抑制因子或癌基因發(fā)揮作用。本研究旨在發(fā)現(xiàn)circRNAs在GCSCs中的表達(dá)譜和功能作用。對(duì)circRNA的全基因組測(cè)序顯示，一種新的circRNA，circSLC4A7是GCSCs中表達(dá)上調(diào)最多的circRNA之一。circSLC4A7定位于細(xì)胞核，其水平在GC細(xì)胞和組織中升高。此外，circSLC4A7增加了CSC樣特性，并驅(qū)動(dòng)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。機(jī)制上，HSP90與circSLC4A7相互作用，通過(guò)激活GC中Notch1信號(hào)通路介導(dǎo)circSLC4A7的致癌功能。本研究強(qiáng)調(diào)了circSLC4A7通過(guò)與HSP90結(jié)合從而激活Notch1信號(hào)通路介導(dǎo)的一種新的致癌功能。本文于2023年7月發(fā)表于Cell Death and Disease（IF=9.0）上。
技術(shù)路線

結(jié)果
1）circRNA在CSCs和MSCs中的表達(dá)譜
       我們的研究首先驗(yàn)證了CSC標(biāo)記物在球體形成實(shí)驗(yàn)后獲得的細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)，并在mRNA和蛋白質(zhì)水平上與單層細(xì)胞(MCs)的標(biāo)記物豐度進(jìn)行了比較(圖1A, B)。接著，我們從3對(duì)GC SCs和MCs中提取總RNA，并進(jìn)行第二代測(cè)序以鑒定差異表達(dá)的circRNA(圖1C)?；蚓垲惙治鲲@示，203個(gè)circRNA表達(dá)上調(diào)，213個(gè)circRNA表達(dá)下調(diào)(圖D)。為了驗(yàn)證基因聚類分析的結(jié)果，我們進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了4株GC細(xì)胞系(MGC803、AGS、BGC823和SGC7901)中6個(gè)上調(diào)最多的circRNA和4個(gè)下調(diào)最多的circRNA的表達(dá)。與MCs相比，CircRNA_0064618 (circ0064618)在4種SCs中的過(guò)表達(dá)水平最高(圖1E)。CD44陽(yáng)性GC細(xì)胞中circ0064618的表達(dá)水平明顯高于CD44陰性細(xì)胞(圖1F)。而且，在GES1細(xì)胞中circ0064168的表達(dá)水平遠(yuǎn)低于GC細(xì)胞系(圖1G)。GC組織中circSLC4A7的表達(dá)水平明顯高于腫瘤鄰近組織(圖1H)。這些結(jié)果提示circ0064618可能在GCSCs中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，AGS和BGC823細(xì)胞中circ0064618的表達(dá)水平高于MGC803和SGC7901細(xì)胞。因此，circ0064618在MGC803和SGC7901細(xì)胞中異位過(guò)表達(dá)，而在AGS和BGC823細(xì)胞中沉默，以研究其生物學(xué)功能。

2）circSLC4A7在胃癌細(xì)胞中的特異性特征及預(yù)后價(jià)值
       Circ0064618由位于3號(hào)染色體的SLC4A7基因編碼(圖2A)，因此，Circ0064618被稱為circSLC4A7。對(duì)RNase R外切酶的抗性證實(shí)了RNA是環(huán)狀的(圖2B)。值得注意的是，在Actinomycin D處理后，circSLC4A7顯示出比SLC4A7 mRNA更長(zhǎng)的半衰期(圖2C)。通過(guò)mRNA分離(圖2D)和FISH (圖2E)的進(jìn)一步檢查表明，circSLC4A7優(yōu)先定位于細(xì)胞核。

3）circSLC4A7的表達(dá)與胃癌的干性呈正相關(guān)
       我們研究了circSLC4A7在GC中的精確功能。用circSLC4A7 shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，在AGS和BGC823細(xì)胞中circSLC4A7的表達(dá)量大大降低，用過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后，在MGC803和SGC7901細(xì)胞中circSLC4A7的表達(dá)量顯著上調(diào)(圖3A)。我們的研究結(jié)果顯示，在GCSCs中circSLC4A7的表達(dá)顯著升高。因此，我們研究了circSLC4A7是否對(duì)干細(xì)胞潛能有影響。Western blotting檢測(cè)表明，在AGS和BGC823細(xì)胞中沉默circSLC4A7可明顯抑制CSC標(biāo)志物SOX2、OCT4、NANOG和CD44的表達(dá)。此外，circSLC4A7過(guò)表達(dá)增加了CSC標(biāo)志物的表達(dá)(圖3B)。此外，在AGS和BGC823細(xì)胞中，敲低circSLC4A7顯著減少了球體形成實(shí)驗(yàn)中腫瘤球體的數(shù)量，異位過(guò)表達(dá)circSLC4A7增加了腫瘤球體形成的數(shù)量(圖3C)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)證實(shí)，circSLC4A7沉默的細(xì)胞中CD44+/CD54+細(xì)胞的比例下降。circSLC4A7過(guò)表達(dá)細(xì)胞中CD44+/CD54+細(xì)胞比例增加(圖3D)。IF實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)NANOG和SOX2在AGS-shcircSLC4A7細(xì)胞和BGC823-shcircSLC4A7細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)(圖3E)，而NANOG和SOX2在MGC803-circSLC4A7細(xì)胞和SGC7901-circSLC4A7細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)(圖3E)。這些結(jié)果表明，circSLC4A7增加了GC細(xì)胞的CSC容量。

4）circSLC4A7加速GC細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖
       為了檢測(cè)circSLC4A7在CSC相關(guān)行為中的作用，我們研究了GC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖能力。一項(xiàng)傷口愈合試驗(yàn)顯示敲低circSLC4A7明顯阻礙了GC細(xì)胞的遷移，異位表達(dá)circSLC4A7促進(jìn)了GC細(xì)胞的遷移(圖4A)。Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這些結(jié)果(圖4B)。此外，我們?cè)诩湫纬珊虲CK-8實(shí)驗(yàn)中證明了抑制circSLC4A7顯著延緩了細(xì)胞增殖，過(guò)表達(dá)circSLC4A7加速了細(xì)胞增殖(圖4C、D)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明circSLC4A7促進(jìn)了GC的遷移、侵襲和增殖。

5）circSLC4A7與HSP90相互作用
       隨后，我們研究了circSCL4A7在GC進(jìn)程中發(fā)揮作用的機(jī)制。為了確定circSLC4A7的蛋白伴侶，我們進(jìn)行了生物素標(biāo)記的RNA下拉實(shí)驗(yàn)，然后對(duì)癌細(xì)胞中的RNA相關(guān)蛋白復(fù)合物進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析。質(zhì)譜分析顯示，BGC823細(xì)胞中有169種蛋白可能與circSLC4A7相互作用。HSP90的表達(dá)發(fā)生了很大的變化(圖5A)。Western blotting進(jìn)一步證實(shí)了HSP90的差異表達(dá)(圖5A)。此外，RIP實(shí)驗(yàn)表明在AGS細(xì)胞和BGC823細(xì)胞中，circSLC4A7在與抗HSP90抗體共沉淀的RNA中內(nèi)源性富集，證明了circSLC4A7與HSP90之間的相互作用(圖5B)。此外，通過(guò)雙RNA-FISH和免疫熒光法鑒定了BGC823細(xì)胞中circSLC4A7和HSP90的重疊定位(圖5C)。調(diào)節(jié)circSLC4A7在AGS和MGC803細(xì)胞中的表達(dá)后，HSP90的表達(dá)不受影響(圖5D)。在siHSP90或siNC轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，circSLC4A7的相對(duì)表達(dá)水平也相當(dāng)(圖5E)。在GES1和GC細(xì)胞(AGS、BGC823、MGC803和SGC7901細(xì)胞)中，HSP90的相對(duì)表達(dá)與circSLC4A7的相對(duì)表達(dá)一致(圖5F)。結(jié)果表明，在GC細(xì)胞中，circSLC4A7與HSP90相互作用。

6）circSLC4A7通過(guò)與GC中的HSP90相互作用發(fā)揮作用
       通過(guò)抑制過(guò)表達(dá)circSLC4A7的細(xì)胞(MGC803-circSLC4A7和SGC7901-circSLC4A7細(xì)胞)中HSP90的表達(dá)，研究HSP90表達(dá)對(duì)GC細(xì)胞中circSLC4A7功能作用的影響。結(jié)果顯示，通過(guò)Western blotting(圖6A)檢測(cè)，HSP90沉默抑制了CSC標(biāo)記物(SOX2, OCT4, NANOG和CD44)的上調(diào)(圖6A)。球體形成實(shí)驗(yàn)中形成的球體數(shù)量的增加也減弱了(圖6B)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，siHSP90逆轉(zhuǎn)了circSLC4A7過(guò)表達(dá)引起的CD44+/ CD54+細(xì)胞比例的增加(圖6C)。IF檢測(cè)顯示，抑制HSP90顯著降低了由異位circSLC4A7表達(dá)引起的CSC標(biāo)志物(NANOG和SOX2)的表達(dá)增加(圖6D)。此外，通過(guò)沉默HSP90也可以抑制過(guò)表達(dá)circSLC4A7的GC細(xì)胞的加速遷移(圖7A、B，上圖)、侵襲(圖7A、B，下圖)和增殖(圖7C、D)?？傊?，這一證據(jù)表明circSLC4A7在GC細(xì)胞中通過(guò)與HSP90相互作用發(fā)揮其功能。

7）circSLC4A7與HSP90結(jié)合，通過(guò)NOTCH信號(hào)通路調(diào)節(jié)GC中的細(xì)胞干性
       包括NOTCH信號(hào)、Wnt信號(hào)、NF-κB信號(hào)和Sonic Hedgehog信號(hào)在內(nèi)的幾個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路在調(diào)節(jié)CSC特性中發(fā)揮重要作用。為了確定這些信號(hào)通路是否介導(dǎo)circSLC4A7/HSP90復(fù)合物在GC中的功能，采用qRT-PCR法檢測(cè)其靶基因的表達(dá)水平。在qRT-PCR檢測(cè)中，Notch信號(hào)通路中基因(NOTCH1、HES6、HEY1、HES1、NARP)的表達(dá)顯著增加(圖8A)。進(jìn)一步的測(cè)量發(fā)現(xiàn)，HSP90沉默逆轉(zhuǎn)了Notch信號(hào)通路中某些基因(NOTCH1、HES6、HEY1和HES1)的上調(diào)表達(dá)，而HSP90過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了Notch信號(hào)通路中某些基因(NOTCH1、HES6、HEY1和HES1)在mRNA和蛋白水平上的抑制(圖8B、C)?？傊?，Notch信號(hào)調(diào)節(jié)circSLC4A7/HSP90復(fù)合物在GC中的功能作用。

結(jié)論
       我們的研究發(fā)現(xiàn)circSLC4A7在不影響HSP90表達(dá)水平的情況下與HSP90相互作用，進(jìn)而激活NOTCH1信號(hào)通路，調(diào)控GC的干性和進(jìn)展。這些結(jié)果表明circSLC4A7是一種新的有希望的GC治療靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)方法
成球試驗(yàn)，RNA pull-down，質(zhì)譜，RIP，qRT-PCR，Western blot，免疫熒光，CCK-8，集落形成試驗(yàn)，創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)，Transwell，F(xiàn)ISH。
參考文獻(xiàn)
Hui Y, Wenguang Y, Wei S, Haoran W, Shanglei N, Ju L. circSLC4A7 accelerates stemness and progression of gastric cancer by interacting with HSP90 to activate NOTCH1 signaling pathway. Cell Death Dis. 2023 Jul 20;14(7):452. doi: 10.1038/s41419-023-05976-w.